Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek
3 maja 2022
Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.
Znaczenie tej metody polega na tym, że umożliwia ona obrazowanie mikrotubul bez znaczników jednocześnie z białkami znakowanymi fluorescencyjnie z dużą liczbą klatek na sekundę. Główną zaletą tej techniki jest jej łatwa implementacja i minimalne wymagania dotyczące komponentów optycznych. Omija również potrzebę znakowania mikrotubul fluoro-4.
Na początek należy przygotować polimer PDMS, łącząc utwardzacz i elastomer bazowy w stosunku masowym 1:10. Mieszaj je przez dwie minuty, a następnie odgazowuj mieszaninę w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Następnie wylej mieszaninę na formę główną warstwą o grubości około 0,5 centymetra, uważając, aby nie tworzyć bąbelków, i piecz mieszaninę w piekarniku nagrzanym do 70 stopni Celsjusza przez 40 minut.
Następnie wytnij strukturalne obszary polimeru i przebij otwory na każdym końcu kanału za pomocą dziurkacza PDMS. Później oczyść strukturalną stronę bloku PDMS. Następnie spłucz trzykrotnie izopropanolem i metanolem, a następnie ultraczystą wodą i wysusz powierzchnię suszarką.
Następnie należy oczyścić plazmowo PDMS za pomocą plazmy tlenowej lub powietrznej i umieścić oczyszczony plazmowo PDMS na odpowiednio oczyszczonym szkle nakrywkowym. Podgrzej go na płycie grzejnej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut. Włóż do otworów rurkę z polietylenu o niskiej gęstości o odpowiedniej wielkości i podłącz rurkę wylotową do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra.
Następnie wlej roztwory do mikrokanalików, zanurzając rurkę wlotową w roztworze i pobierając wymaganą objętość za pomocą strzykawki. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i włącz źródło światła epi-illumination do obrazowania IRM. Aby ustawić ostrość mikroskopu, poszukaj właściwej płaszczyzny ogniskowej w pobliżu interfejsu rozwiązania PDMS i wybierz pole widzenia w pobliżu środka kanału.
Następnie należy przygotować 0,1-mikromolowy roztwór mikrogranulek fluorescencyjnych w BRB80 i przepuścić co najmniej jedną objętość kanału roztworu mikrogranulek. Monitoruj reakcję za pomocą IRM lub TIRF. Po osiągnięciu pożądanej gęstości mikrogranulek zmyj nadmiar BRB80.
Przelej rozcieńczone nasiona do komory reakcyjnej i monitoruj reakcję za pomocą IRM. Po osiągnięciu pożądanej gęstości nasion zmyj nadmiar BRB80. Następnie należy przygotować mieszaninę do przedłużania mikrotubul zawierającą 12-mikromolową nieznakowaną tubulinę, jednomilimolową GTP, pięciomilimolową DTT w buforze BRB80.
Następnie przelej co najmniej jedną objętość kanałową mieszaniny przedłużającej, upewniając się, że temperatura reakcji wynosi 28 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, ustaw ustawienia obrazowania w oprogramowaniu mikroskopu. Rozpocznij obrazowanie i wlej roztwór kinezyny do komory.
Następnie wyobraź sobie niekurczliwe mikrotubule kinezyny 1 oznaczone GFP. Po zakończeniu pomiaru nagraj krótki film, w którym stolik jest powoli przesuwany ruchem okrężnym lub bocznym. Mediana projekcji tego filmu posłuży jako obraz tła i zostanie odjęta od surowych pomiarów.
Utwórz projekcję mediany w ImageJ z nagrania w tle, klikając Obraz. Następnie wybierz opcję Stosy i kliknij Z Project. Następnie odejmij medianę projekcji tła od surowych danych obrazu, klikając Proces, a następnie wybierz opcję Kalkulator obrazu, upewniając się, że zaznaczyłeś opcję 32-bitowego wyniku zmiennoprzecinkowego.
Aby zarejestrować obraz, wybierz kolekcję mikrokulek w pobliżu interesującej nas mikrotubuli i użyj ich do wyrównania obrazów TIRF i IRM. Dla każdego ściegu w tej kolekcji użyj narzędzia do zaznaczania wielopunktowego, aby zaznaczyć przybliżone położenie w kanale TIRF, a następnie odpowiadające mu położenie w kanale IRM. Następnie uruchom dostarczone makro ImageJ.
Mikrogranulki pojawiają się jako ciemne plamy w kanale IRM po prawej stronie i jako jasne punkty w kanale TIRF po lewej stronie. Procedura wyrównywania prawidłowo nakłada się na dwa kanały, lokalizując wybrane koraliki. Przy użyciu tego protokołu uzyskano również kymogram cząsteczek kinezyny znakowanych EGFP poruszających się w kierunku kurczących się końców mikrotubul.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wybrać obiektywy o dużej aperturze numerycznej, aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, a także zmaksymalizować wydajność zbierania i kontrast obrazu. Metoda ta może być stosowana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych jednocześnie w strukturze makromolekularnej wystarczająco masywnej, aby można ją było uwidocznić za pomocą IRM, takiej jak błona komórkowa lub włókno aktynowe. Protokół ten zapewnia również łatwą do dostosowania procedurę jednoczesnego obrazowania z dowolną kombinacją IRM, TIRF i epifluorescencji.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół implementacji mikroskopii interferencyjno-odbiciowej (IRM) oraz mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) w celu jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul oraz znakowanych fluorescencyjnie białek związanych z mikrotubulami. Metoda ta umożliwia obrazowanie bezznakowych mikrotubul wraz z białkami fluorescencyjnymi przy wysokiej częstotliwości klatek, co usprawnia badanie dynamiki komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Wprowadzenie
- IRM i TIRF to zaawansowane techniki obrazowania wykorzystywane do wizualizacji komponentów komórkowych.
- Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w strukturze i funkcjonowaniu komórek.
- Do badania białek powszechnie stosuje się znakowanie fluorescencyjne, które może jednak komplikować obrazowanie mikrotubul.
- Niniejszy protokół ma na celu uproszczenie procesu obrazowania przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnej metody do jednoczesnego obrazowania mikrotubul i białek z nimi związanych.
- Zaprezentowanie zalet wykorzystania IRM i TIRF w badaniach dynamicznych.
- Umożliwienie obrazowania o wysokiej rozdzielczości bez konieczności stosowania złożonych technik znakowania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie polimeru PDMS do wytwarzania mikrokanałów.
- Wprowadzanie roztworów do mikrokanałów w celu wykonania obrazowania.
- Konfiguracja parametrów obrazowania mikroskopu dla uzyskania optymalnych wyników.
- Wykorzystanie programu ImageJ do przetwarzania obrazów oraz dopasowania obrazów TIRF i IRM.
Główne wyniki
- Skuteczne jednoczesne obrazowanie mikrotubul i białek znakowanych fluorescencyjnie.
- Wizualizacja w wysokiej rozdzielczości cząsteczek kinezyny oddziałujących z mikrotubulami.
- Efektywne dopasowanie obrazów TIRF i IRM przy użyciu mikrokulek.
- Wykazanie możliwości adaptacji protokołu do różnych kombinacji obrazowania.
Wnioski
- Protokół oferuje prosty sposób badania dynamiki mikrotubul.
- Metody IRM i TIRF można skutecznie łączyć w celu zwiększenia możliwości obrazowania.
- Metodę tę można zastosować w różnych systemach biologicznych w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Jednoczesne zastosowanie mikroskopii IRM i TIRF umożliwia szybkie obrazowanie dwukanałowe dynamicznych mikrotubul oraz powiązanych z nimi białek, bez konieczności rozległego znakowania lub stosowania złożonych układów optycznych. Możliwość ta wspiera wczesny etap walidacji celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego, zapewniając ilościową wizualizację bez użycia znaczników wraz z detekcją fluorescencyjną pojedynczych cząsteczek. Podejście to usprawnia procesy obrazowania, zmniejsza ryzyko fotobleachingu i zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad białkami cytoszkieletu, istotnych dla procesów odkrywania leków w biofarmaceutyce.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację interakcji białko-mikrotubula w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wizualizację dynamicznych procesów cytoszkieletowych w czasie rzeczywistym.
- Ułatwia testowanie hipotez dotyczących lokalizacji i mobilności białek bez artefaktów związanych z znakowaniem.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę obrazowania do ilościowej analizy dynamiki białek.
- Zmniejsza złożoność testu poprzez wyeliminowanie konieczności podwójnego znakowania oraz stosowania dodatkowych źródeł wzbudzenia.
- Umożliwia przygotowanie do screeningu wysokoprzepustowego dzięki obrazowaniu obu kanałów na jednym chipie kamery.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera badania nad dynamiką cytoszkieletu zaangażowaną w procesy neurodegeneracyjne i onkologiczne, co pozwala na dopasowanie do systemów istotnych w kontekście chorób.
- Zapewnia ciągłość translacyjną, umożliwiając rozdzielczość na poziomie pojedynczych cząsteczek w środowiskach istotnych fizjologicznie.
- Usprawnia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka dzięki solidnym, ilościowym wynikom obrazowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta dwutrybowa metoda obrazowania integruje się z kontinuum procesu odkrywczego, od wczesnych badań mechanistycznych, poprzez opracowywanie testów, aż po walidację przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie funkcji białek związanych z mikrotubulami oraz mapowanie szlaków w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do oceny związków i przesiewania fenotypowego.
- Analityka: Umożliwia uzyskanie wysokorozdzielczych, zsynchronizowanych odczytów do bezpośredniego porównania dynamiki białek i filamentów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przejścia od mechanistycznych badań in vitro do systemów modelowych istotnych dla konkretnych jednostek chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną platformę obrazowania, którą można dostosować do różnych celów związanych z cytoszkieletem i błonami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Upraszcza procesy obrazowania i zwiększa powtarzalność wyników pomiędzy zespołami.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu oraz efektywne kapitałowo rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów cytoszkieletowych i powiązanych z nimi szlaków z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie zaawansowanej mikroskopii oraz oprogramowania do analizy obrazów, takiego jak ImageJ.
- Niezbędny jest dostęp do obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej oraz kompatybilnych mikroskopów z możliwością obrazowania TIRF/IRM.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie procedur rejestracji obrazów i korekcji tła.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym w przypadku filamentów aktynowych i błon komórkowych, przy minimalnych zmianach w protokole.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność precyzyjnego dopasowania oraz potencjalne ograniczenia przepustowości w przypadku przesiewów na dużą skalę.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Preparation of PDMS Channels
2:15
Preparation for Imaging
3:02
Growing Dynamic Guanosine Diphosphate “Extensions”
3:46
Kinesin Motility Assay
4:23
Image Processing and Analysis
5:22
Results: Imaging of Dynamic Microtubules and Fluorescently Labeled Microtubule-Associated Proteins
5:57
Conclusion
