Tworzenie przejściowych porów w błonie komórkowej przy użyciu standardowej drukarki atramentowej

Ogólnym celem tej procedury jest utworzenie przejściowych porów w błonach komórkowych przy użyciu druku atramentowego. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednią modyfikację standardowej drukarki atramentowej. Drugim krokiem jest opróżnienie i wyczyszczenie fabrycznego wkładu z tuszem, aby umożliwić wprowadzenie bioatramentu.

Następnie badane komórki zawiesza się w roztworze monomerów aktyny znakowanych fluorescencyjnie i PBS, aby przygotować roztwór biotuszu. Ostatnim krokiem jest nadrukowanie biotuszu na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu zmodyfikowanej drukarki i wkładu. Ostatecznie można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną, aby wykazać, że sprzężone z Fluor four monomery G-aktyny zostały wchłonięte przez wydrukowane komórki poprzez przejściowe pory w błonie.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do standardowej transfekcji i mikroiniekcji komórek jest łatwość jej stosowania oraz wysoka przeżywalność komórek. Choć technika ta może dostarczać cennych informacji w dziedzinie genetyki, może być również wykorzystywana w innych obszarach badawczych, takich jak biofizyka komórki i inżynieria tkankowa. Metoda ta umożliwia łatwą obserwację cytoszkieletu komórki podczas jej migracji.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy umożliwić wizualizację zmian w układzie cytoszkieletu pod wpływem sił przyłożonych do komórek. Należy rozpocząć od odblokowania plastikowych zacisków u podstawy drukarki, a następnie powoli zdjąć górną plastikową obudowę. Następnie należy odłączyć panel świetlny wyświetlacza przycisków z górnej części drukarki, pozostawiając go podłączonym do płyty głównej drukarki.

Używając chusteczek Kim wipes i etanolu, należy oczyścić wnętrze drukarki, szczególnie obszary, w których spoczywa kartridż z tuszem oraz miejsca, w których odbywa się druk. Następnie należy zlokalizować kabel zasilający mechanizmy podawania papieru w drukarce HP desk Jet 500.

Znajdują się one tuż poniżej tacy papieru po lewej stronie z przodu; należy odłączyć kable od płyty głównej. Teraz należy zlokalizować mechanizm wykrywania papieru i przymocować pętlę z drutu do szarej plastikowej dźwigni znajdującej się powyżej i za mechanizmem podawania papieru do druku, aby służyła jako uchwyt manualny, a następnie umieścić tutaj podstawkę. Piankowy uchwyt transportowy na 15 probówek do wirowania jest wykorzystywany wraz z kilkoma przyklejonymi taśmą szkiełkami mikroskopowymi w obszarze druku przed mechanizmem podawania papieru, aby doprowadzić wybrane szkiełka do druku na poziom tuż poniżej głowicy drukującej kartridża.

Na koniec, aby zachować technikę aseptyczną, umieść drukarkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rozpocznij od wyjęcia wkładu z opakowania, pozostawiając taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą. Stabilizuj korpus wkładu za pomocą zacisku, pozostawiając zieloną górną część wolną od przeszkód, używając ręcznego obrotowego narzędzia tnącego.

Odetnij zieloną górną część wkładu, opróżnij zbiornik z pozostałego tuszu, a następnie usuń plastikową taśmę ochronną zakrywającą styki drukarki i głowicę drukującą. W trakcie tego procesu z głowicy drukującej prawdopodobnie będzie wyciekać woda, co nie wyrządzi jednak żadnej szkody wkładowi. Gdy woda przestanie być zabarwiona, pozwól wkładowi wyschnąć.

Aby zachować czystość środowiska drukowania, należy rozpocząć od całkowitego zanurzenia kartridża w zlewce z wodą dejonizowaną, a następnie poddać go sonikacji przez 15 minut. Po sonikacji należy wyjąć kartridż i strząsnąć nadmiar wody. Do wnętrza kartridża należy rozpylić 70% ethanol, aby stworzyć bardziej aseptyczne środowisko.

Po zebraniu interesujących komórek, odwiruj je w 5 ml świeżego medium w 15 ml stożkowej probówce wirówkowej przez 5 minut przy 250 ×g w temperaturze pokojowej. Następnie odessaj medium, a komórki resuspenduj w świeżo przygotowanym roztworze stokowym fluorescencyjnej G aktyny w stężeniu 1 × 10⁵ komórek/ml. W celu przygotowania bioatramentu należy pamiętać, że 250 µL bioatramentu wystarcza do wydrukowania trzech szkiełek podstawowych z zaprezentowanym tutaj wzorem liniowym. Po włączeniu i rozgrzaniu drukarki umieść w tym miejscu odpowiednią powierzchnię druku; na środku wcześniej zmontowanego stolika stosuje się szkiełka podstawowe o wymiarach 22 mm × 22 mm.

Następnie otwórz program do rysowania i wybierz żądany wzór. Teraz pipetuj około 100 do 120 µL zawiesiny komórek do małego okrągłego otworu na dnie przedziału na kartridż. Wydrukuj plik; gdy drukarka ponownie się rozgrzeje, kartridż przesunie się do pozycji gotowości.

Gdy wkład przesunie się lekko w lewo względem otworu do ociekania tuszu i zatrzyma się w tej pozycji, należy pociągnąć do góry mechanizm podawania papieru i drut, co rozpocznie drukowanie. Drukarka HP DeskJet 500 wydrukuje obraz na szkiełku nakrywce umieszczonej w centrum platformy drukującej, wykorzystując biotusz składający się z zawiesiny fibroblastów w roztworze monomeru G-aktyny.

Wewnątrz wkładów atramentowych z serii HP 26 wydrukowano komórki fibroblastów na szklanych szkiełkach nakrywkowych do mikroskopu. Rysunek ten przedstawia reprezentatywny wynik drukowania komórek fibroblastów, w których wbudowano fluorescencyjne monomery aktyny. Wzorzec ten został wykorzystany na poprzednim rysunku do utworzenia ciągłej linii roztworu drukującego na większości powierzchni szkiełka mikroskopowego.

Na tej rycinie przedstawiono linię prostą, w której wzajemnie naniesiono bioatrament i komórki. Należy zauważyć, że bezpośrednio po drukowaniu następuje wzrost fluorescencji tła, ponieważ roztwór bioatramentu, w którym zawieszone są komórki, zawiera wolne nadmiarowe fluorescencyjne monomery aktyny; inkubowanie komórek przez około 10 minut po drukowaniu ułatwia ich przyleganie do szkiełka, co pozwala na wypłukanie nadmiarowego roztworu monomeru z podłoża za pomocą świeżej pożywki wzrostowej, znacząco redukując fluorescencję tła. Tutaj przedstawiono reprezentatywny obraz trzech fibroblastów 3T3 wydrukowanych w zlokalizowanej strefie druku; ta mikrofotografia z mikroskopii fluorescencyjnej komórki wykonana 15 minut po drukowaniu pokazuje aktynę G w kolorze zielonym, jądro w kolorze niebieskim oraz nałożenie obrazu aktyny G i barwnika jądrowego.

Dwa kolejne obrazy przedstawiają mikroskopię fluorescencyjną dwóch fibroblastów ułożonych w linii trzy godziny po druku. Pierwszy obraz pokazuje fluorescencyjnie znakowane monomery aktyny wewnątrz komórek. Drugi obraz jest nałożeniem kanału fluorescencyjnego na obraz tła, co pokazuje, że mimo obecności pewnych zanieczyszczeń na preparasie w lewym dolnym rogu, nie wykazują one fluorescencji.

Na koniec przedstawiono grupę kontrolną komórek niedrukowanych, inkubowanych przez trzy godziny z monomerami znakowanymi fluorescencyjnie, aby wykazać, że monomery nie mogą przenikać przez błonę komórkową bez jej permeabilizacji dokonanej podczas drukowania komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć przygotowanych i wyczyszczonych kilka wkładów, ponieważ zapychanie się drukarki jest jednym z problemów spowalniających tę technikę. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przekształcić standardową drukarkę biurkową w celu drukowania żywych komórek, co pomaga w wytworzeniu przejściowej siły błonowej.