Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie analizy metylacji DNA dinukleotydów CpG poprzez sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji siarczynami. Osiąga się to najpierw poprzez denaturację dwuniciowego DNA, aby umożliwić zajście reakcji konwersji pirosiarczynowej. Drugim krokiem jest konwersja wszystkich niemetylowanych cytozyn w DNA genomicznym do uracylu poprzez deaminację pirosiarczynową.

Reakcja ta składa się z trzech etapów. Pierwszym jest sulfatowanie reszty cytozyny poprzez addycję siarczynu B do wiązania podwójnego między piątym a szóstym atomem węgla. Po drugie, hydrolityczna deaminacja cytozyny przez pochodną siarczynu prowadzi do powstania SSL w postaci pochodnej siarczynowej, a po trzecie, usunięcie grupy sulfonianowej poprzez traktowanie zasadą skutkuje powstaniem reszty SSL.

Następnie region docelowy jest amplifikowany za pomocą specyficznych starterów do konwersji pirosiarczynowej oraz poprzez reakcję PCR. Końcowym etapem jest klonowanie i sekwencjonowanie produktu PCR, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości pojedynczego nukleotydu dla metylacji w obrębie cząsteczki DNA. Ostatecznie wyniki wykazują metylację DNA dinukleotydów CpG w DNA genomicznym poprzez wykorzystanie zwiększonej wrażliwości cytozyny w stosunku do 5-metylocytozyny na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza krwi metodą Southern, jest możliwość uzyskania rozdzielczości pojedynczych nukleotydów w przypadku metylacji DNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak rola metylacji DNA w chorobach ludzkich, na przykład w nowotworach. Aby przygotować próbki DNA do konwersji pirosiarczynowej, najpierw inkubuj 2 µg genomicznego DNA z pirosiarczynem, buforem do lizy DNA do uzyskania całkowitej objętości 18 µl przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Następnie zdenaturować DNA genomowe, dodając 2 µL świeżo przygotowanego 3 M wodorotlenku sodu do stężenia końcowego 0,3 M. Próbki inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 90 °C przez dwie minuty. Po wyjęciu z bloku grzewczego natychmiast umieścić probówki na lodzie na pięć minut, a następnie odwirować probówki przez 10 sekund przy 10 000 ×g, aby upewnić się, że DNA znajduje się na dnie probówki. Próbki zdenaturowanego DNA są teraz gotowe do deaminacji limfocytów B, która zostanie omówiona w kolejnym kroku.

Przed reakcjami sulfatacji i deaminacji hydrolitycznej należy przygotować świeże roztwory 10 milimolarnego chinolu oraz nasyconego pirosiarczynu sodu o pH 5,0. Ponieważ roztwór pirosiarczynu sodu jest nasycony, mogą pozostać nierozpuszczone niewielkie grudki. Do 20 µL zdenaturowanego DNA należy dodać 208 µL pirosiarczynu sodu oraz 12 µL chinolu, tak aby końcowa objętość wynosiła 240 µL.

Wymieszaj zawartość probówek na wortexie i wiruj przez 10 sekund, aby upewnić się, że wszystkie kropelki znajdują się na dnie probówki. Przykryj próbki olejem mineralnym. Inkubuj próbki w kąpieli wodnej w temperaturze 55 °C przez okres od 4 do 16 godzin, w zależności od ilości i jakości konwertowanego DNA.

Ważne jest, aby konwersja pirosulfite odbywała się w ciemności, aby uniknąć utleniania. Po upływie odpowiedniego czasu inkubacji krótko wiruj probówki w mikrowirowce, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki. Następnie ostrożnie odpipetuj roztwór DNA z dna probówki, nie pobierając oleju mineralnego.

W kolejnych krokach nasze laboratorium wykorzystuje system oczyszczania DNA Promega Wizard. Do próbek DNA należy dodać 1 mL żywicy, odwrócić probówkę w celu wymieszania, a następnie nanieść roztwór pipetą do strzykawki podłączonej do kolumny odsalającej. Na koniec, aby usunąć wolne jony pirosiarczynowe, należy przepuścić DNA poddane działaniu pirosiarczynu przez kolumnę odsalającą i rozpuścić je w 50 µL wody Milli Q.

Kolejnym krokiem jest usunięcie grupy bisulfitowej z pierścienia uracylu poprzez odsalanie. Aby to osiągnąć, do każdej próbki DNA poddanej działaniu bisulfitu należy dodać 5,5 µL świeżo przygotowanego 3 M wodorotlenku sodu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,3 M. Następnie próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

Krótko odwiruj próbki, a następnie dodaj jeden mikrolitr TRNA do każdej z nich. Zneutralizuj roztwór, dodając octan amonu do stężenia końcowego 3 M. Następnie przeprowadź precypitację DNA za pomocą etanolu.

Dodać 330 µL lodowatego, 100% etanolu i dokładnie wymieszać poprzez odwracanie probówki. Pozostawić w temperaturze -20 °C przez jedną godzinę lub przez noc, a następnie odwirować przy 14 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie usunąć wszystkie ślady supernatantu i wysuszyć wytrącone DNA na powietrzu przez około 20 minut.

Po wysuszeniu na powietrzu osad jest niemal niewidoczny; należy resuspendować osad DNA w 50 µL 0,1 XTE lub wody i pozostawić w temperaturze pokojowej przez około dwie godziny. W tym czasie należy sporadycznie wierzgać próbki w wirówce typu vortex, aby upewnić się, że DNA uległo rozpuszczeniu, a następnie krótko odwirować. Po rozpuszczeniu DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C od jednego do 10 lat, w zależności od ilości i jakości DNA, lub użyć natychmiast. W przypadku amplifikacji PCR najtrudniejszym aspektem tej procedury jest optymalizacja starterów.

W związku z tym sformułowano następujące wytyczne, aby pomóc zapewnić sukces projektowania starterów. Aby zilustrować te wytyczne, sekwencja docelowa została poddana konwersji siarczynowej, dzięki czemu w zapisie konwertowane cytozyny pojawiają się jako niebieskie T, a niekonwertowane miejsca CpG jako czerwone cg. Startery powinny mieć długość od 24 do 30 par zasad, aby zapewnić specyficzność. Startery powinny mieć podobną przewidywaną TM powyżej 50°C i nie różnić się od siebie o więcej niż 1–2°C.

Startery powinny zawierać od 25% do 30% zasad C i T, aby zapewnić specyficzność konwersji. Ostatnia zasada na końcu 3' powinna być C lub T, aby zapewnić amplifikację konwertowanego DNA. Należy unikać dinukleotydów CpG w sekwencji startera, aby zapobiec potencjalnemu odchyleniu w stronę matryc zmetylowanych, niezmetylowanych lub niekonwertowanych. Jeśli jednak jest to nieuniknione, cytozynę w miejscu CpG należy zastąpić zasadą Y, aby pomóc zapewnić bezstronną amplifikację konwertowanego DNA.

Na koniec, jeśli jest to wymagane, zaprojektuj zestawy starterów zagnieżdżonych lub półzagnieżdżonych, aby zapewnić swoistość lub czułość reakcji PCR. Przygotuj mieszaniny reakcyjne do amplifikacji PCR w alikwotach 25 µL w celu optymalizacji. Każda reakcja zawiera konwertowany siarczynem DNA genomiczny, primery DPS, chlorek magnezu, chlorek potasu, TRIS-HCl pH 8.3 oraz polimerazę w celu przetestowania błędu amplifikacji materiału zmetylowanego lub niezmetylowanego.

Aby sprawdzić proporcjonalność amplifikacji PCR po konwersji pirosiarczynowej, należy użyć próbki kontrolnej składającej się w proporcji 50:50 z DNA zmetylowanego i niezmetylowanego, w pełni poddanego konwersji pirosiarczynowej. Przy użyciu specyficznych starterów i mieszaniny reakcyjnej PCR w termocyklerze z gradientem temperatury, należy przeprowadzić reakcję w gradiencie plus lub minus 3 °C od TM starterów w 8 do 10 probówkach; przed umieszczeniem ich w termocyklerze probówki należy wymieszać w wortexie i krótko odwirować w mikrocentryfudze. Na tej ilustracji przedstawiono żel agarozowy z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperatury dla mieszaniny 50% zmetylowanego i niezmetylowanego DNA.

Amplikony PCR w ścieżkach oznaczonych jako T (ścieżki druga, piąta i ósma) zostały poddane działaniu enzymu restrykcyjnego, który trawi wyłącznie zmetylowane DNA. Optymalne warunki amplifikacji PCR powinny pozwolić na proporcjonalne i nieobciążone wzmocnienie amplikonów zmetylowanych i niezmetylowanych, co skutkuje równą ilością przeciętego i nieprzeciętego produktu PCR, jak pokazano tutaj. Optymalne warunki termocyklingu dla nieobciążonej amplifikacji wynoszą 55,6 °C. Całkowitą konwersję DNA poddanego działaniu siarczynu można przeanalizować poprzez trawienie enzymem specyficznym dla miejsca cytozyny, który trawi wyłącznie niepodlegające konwersji DNA w ścieżkach trzeciej, szóstej i dziewiątej.

Pełna konwersja DNA pirosiarczynem jest tutaj wskazana przez brak pociętego DNA we wszystkich trzech ścieżkach: trzeciej, szóstej i dziewiątej. Ten wykres dysocjacji w czasie rzeczywistym pokazuje równą proporcję zmetylowanego i niezmetylowanego DNA (pomarańczowa linia, mieszanina 50:50) w porównaniu do amplifikacji w pełni zmetylowanego DNA (różowa linia m) i niezmetylowanego DNA (zielona linia U), które dysocjują odpowiednio w 82,9 °C i 86,9 °C. Wskazuje to na brak błędu amplifikacji wynikającego z temperatury, w której dysocjują poszczególne cząsteczki.

Powstałe fragmenty PCR z amplifikacji próbek poddanych traktowaniu pirosiarczynem można wizualizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i sekwenować. Przedstawiony tutaj ślad sekwencjonowania pochodzi z trzech różnych linii komórkowych, z zaznaczonymi na żółto miejscami CpG; linia komórkowa X wykazuje 100% metylacji we wszystkich trzech miejscach CpG, podczas gdy linie komórkowe Y i Z wykazują różny stopień metylacji, co widać po nakładających się sygnałach G i A. Rysunek 4A przedstawia ślad sekwencjonowania z trzech różnych linii komórkowych z zaznaczonymi na żółto miejscami CpG.

Po bezpośrednim sekwencjonowaniu poszczególnych klonów stan metylacji pojedynczych cząsteczek można zestawić w mapie bisulfitowej. Aby zwizualizować heterogeniczność metylacji, gęstość metylacji w poszczególnych miejscach CpG przedstawiono kolorem czerwonym. Ta reprezentatywna mapa bisulfitowa obrazuje wysokoprzepustową ilościową analizę metylacji próbki.

Wykorzystanie technologii sequenome epi typer pozwala na uzyskanie specyficznego widma zależnego od obecności zmetylowanych cytozyn, co przedstawiono w przykładzie na rysunku 5A. Podsumowanie stosunków w próbce może następnie zostać wyekstrahowane w formie epigramu na rysunku 5B. Ten przykład pokazuje procent metylacji DNA w każdym miejscu CpG dla czterech różnych linii komórkowych. Wreszcie, po jego opracowaniu, z epigramu można wyprowadzić podsumowujący wykres metylacji na rysunku 5C. Technika ta otworzyła przed badaczami w dziedzinie epigenetyki drogę do eksploracji metylacji DNA i jej roli w chorobach ludzi.