Wytwarzanie urządzeń z PDMS oraz modyfikacja powierzchni

Nazywam się Ken Kotz. Jestem pracownikiem posutdoctoralnym w Bio MAs Resource Center powiązanym z Massachusetts General Hospital. Mój główny projekt badawczy polega na izolowaniu neutrofili przy użyciu urządzenia do wychwytu z powinowactwem immunologicznym z zastosowaniem struktur mikrofluidycznych.

Urządzenia tego używamy w pięciu różnych szpitalach w całym kraju do izolacji RNA na potrzeby późniejszych analiz genomicznych. W zasadzie mamy tutaj warstwę fotorezystu SU-8 na podłożu krzemowym. Na tę formę wylejemy dwuskładnikowy elastomer PDMS, który posłuży do stworzenia odlewu.

Wyjmujemy formę matkę z etui i umieszczamy ją w czalce Petriego. Formę matkę mocujemy taśmą do dna czalki Petriego. Na wadze odmierzamy mieszaninę PDMS, utwardzacza i żywicy bazowej.

Stosunek utwardzacza do żywicy wynosi 1:10. Zazwyczaj w przypadku naszych wyciętych urządzeń odważamy od 20 do 30 g żywicy oraz odpowiednio od dwóch do trzech g utwardzacza. Po przelaniu utwardzacza i żywicy do małej łódki ważkiej, mieszamy oba składniki za pomocą standardowego plastikowego widelca.

Należy upewnić się, że mieszanina jest intensywnie mieszana i wielokrotnie przekładana, aby zapewnić równomierne rozłożenie utwardzacza w żywicy. Zazwyczaj monitorujemy stopień wymieszania obu składników. Obserwując liczbę pęcherzyków powietrza, staramy się uzyskać równomierny rozkład małych pęcherzyków powietrza w całym elastomerze.

Następnie wylewamy PDMS na matrycę SU-8 znajdującą się w szalce Petriego. Matrycę z naniesionym PDMS umieszczamy w kolbie próżniowej i odsysamy powietrze z komory, aby odgazować mieszaninę. Proces odgazowywania trwa zazwyczaj od 30 minut do jednej godziny.

Po odgazowaniu wyjmujemy urządzenia z komory próżniowej i umieszczamy je w piecu w temperaturze od 65 do 80 °C. Minimalny czas utwardzania w tych temperaturach wynosi od trzech do sześciu godzin. W naszym laboratorium urządzenia zazwyczaj pozostawiamy w piecu przez noc.

Zazwyczaj używamy chirurgicznego skalpela z ostrzem nr 11. Wykonujemy proste nacięcia na głębokość około połowy centymetra od krawędzi matrycy silikonowej i wycinamy obszar wokół krawędzi matrycy, tworząc duży dysk. Odklejamy formę PDMS od matrycy i umieszczamy ją stroną z wytłoczeniami do góry w czystej szalce Petriego.

Wyjmujemy uwolnioną formę z szalki Petriego i umieszczamy ją na powierzchni do cięcia, używając noża lub noża zamontowanego na prowadnicy liniowej. Wycinamy urządzenia znajdujące się w formie. Każde wycięte urządzenie jest następnie umieszczane z powrotem w szalce Petriego w celu dalszej obróbki.

Zazwyczaj, aby połączyć nasze urządzenia z cieczami, wykonujemy otwory w urządzeniu z PDMS. Do wykonywania otworów używamy standardowej strzykawki 3 mm. Na końcówce strzykawki 3 mm znajduje się tępa igła ze stali nierdzewnej.

Wewnątrz igły ze stali nierdzewnej znajduje się drut dopasowany do jej średnicy wewnętrznej. Drut ten jest przymocowany do tłoka strzykawki. Przeciągając tłok i wycofując igłę, można wykonać otwór lub wyciąć otwór w PDMS. Odwróć urządzenie z PDMS i usuń go, naciskając tłok.

Kluczem do prawidłowego użycia wycinaka jest utrzymanie tłoka w pozycji jak najbardziej pionowej oraz całkowite unikanie obracania urządzenia. Podczas wycinania otworu w PDMS należy unieść całe urządzenie z PDMS za pomocą pęsety, odwrócić je i wypchnąć wkładkę, naciskając tłok. Następnie należy chwycić wkładkę pęsetą i ją zutylizować.

Następnie ponownie cofamy tłok, odchylamy urządzenie w dół i wyjmujemy urządzenie tnące. Czynność tę powtarzamy do momentu wykonania wszystkich otworów. W procesie wiązania przytwierdzamy nasze urządzenia z PDMS do szkiełek przedmiotowych.

W przypadku naszych urządzeń, PDMS zostanie nieodwracalnie związany lub kowalencyjnie przytwierdzony do szkiełek przedmiotowych. Osiąga się to poprzez umieszczenie ich w urządzeniu do trawienia plazmowego (plasma Asher) i poddanie działaniu reaktywnej plazmy tlenowej. Kroki niezbędne do wykonania tej procedury polegają na pobraniu urządzenia z PDMS i umieszczeniu go na tacy urządzenia do trawienia plazmowego.

Ustawiając urządzenie elementami aktywnymi do góry, można zastosować dowolne standardowe szkiełko przedmiotowe. W naszym urządzeniu wykorzystujemy nieco większe szkiełko o długości 1,5 cala. Można ich używać bezpośrednio po wyjęciu z opakowania.

Preferujemy ich traktowanie w roztworze piranha. Pozwala to usunąć wszelkie zanieczyszczenia organiczne, które mogą znajdować się na powierzchni szkiełka przedmiotowego. Po umieszczeniu urządzenia i szkiełka na tacy do urządzenia do trawienia plazmowego (plasma Asher), należy wsunąć tacę do urządzenia i poddać próbkę działaniu reaktywnej plazmy tlenowej.

Po zakończeniu programu w urządzeniu do trawienia plazmowego (plasma Asher), otwieramy komorę i przenosimy płytkę z naszymi urządzeniami na blat laboratoryjny. Za pomocą pęsety ostrożnie podnosimy urządzenie z PDMS, uważając, aby nie dotknąć palcami powierzchni wiązania. Odwracamy stronę wiązania i przykładamy ją do szkiełka przedmiotowego, a następnie upewniamy się, że między PDMS a szkiełkiem nie pozostały pęcherzyki powietrza.

Urządzenie z PDMS, teraz przytwierdzone do szkła, umieszczamy na płytce grzejnej w temperaturze od 65 do 75 °C przez 10 minut, aby uzyskać lepsze wiązanie chemiczne. Zatem w tej części, w tej sekcji, będziemy chemicznie modyfikować powierzchnie PDMS i szkła po procesie wiązania w pomieszczeniu czystym; pozostaje nam powierzchnia PDMS, która posiada na powierzchni reaktywne grupy OH. Ta reaktywna powierzchnia jest hydrofilowa i z czasem ulegnie dyfuzji do wnętrza materiału PDMS.

Ponieważ modyfikację chemii powierzchni najlepiej przeprowadzić bezpośrednio po obróbce plazmą, użyjemy 5% roztworu trimetoksysilil propyltrimetylammonium. Jest to 5% roztwór objętościowy; wlewamy go przez wlot, upewniając się, że urządzenie zostało całkowicie wypełnione i nie ma w nim pęcherzyków powietrza.

Jeśli pojawiły się pęcherzyki powietrza, należy je usunąć za pomocą pęsety. Po wstrzyknięciu slanu, należy pozostawić go na 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj w 10. minucie reakcji wstrzykujemy drugą objętość slanu.

Po reakcji silanizacji trwającej około pół godziny, przepłuczemy wszystkie urządzenia od trzech do czterech objętości urządzeń czystym etanolem. Nadmiar cieczy usuniemy za pomocą chusteczki bezpyłowej. Po przepłukaniu urządzeń przeniesiemy je na płytkę grzejną ustawioną na 100 °C, aby pozwolić zawartemu w nich etanolowi odparować. Pomaga to utrwalić powierzchnię silanizowaną.

Po wysuszeniu urządzenia można je przechowywać w eksykanym środowisku przez wiele miesięcy lub można niezwłocznie przejść do następnego kroku. Po utwardzeniu urządzenia posiadają one powłokę silanową zarówno na powierzchni szkła, jak i PDMS. Zastosowany silan to capto-silan z grupą tiolową, która wejdzie w reakcję z heterobifunkcyjnym sieciującym GMBS.

Jest on rozcieńczony w czystym etanolu. Substancja ta reaguje z wodą, dlatego należy uważać, aby nie dopuścić do kontaktu z warunkami wodnymi. Wstrzykujemy go do urządzeń i usuwamy pęcherzyki powietrza za pomocą pęsety, tak jak robię to teraz, aby upewnić się, że wszystkie powierzchnie są pokryte tą cząsteczką.

Przykrywamy naczynie i pozostawiamy do reakcji na pół godziny. Po tym, jak GMBS zareaguje przez pół godziny, przepłuczemy urządzenia wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie ślady etanolu znajdujące się w urządzeniu. Następnie przepuścimy neutravin, który jest białkiem wiążącym biotynę.

Następnie neutravain jest wstępnie rozcieńczony do stężenia 10 µg/ml. Jeśli do urządzenia zostanie przypadkowo wstrzyknięte powietrze, urządzenie będzie wymagało ponownego przepłukania etanolem, aby skutecznie usunąć całe powietrze; etanol lepiej zwilża powierzchnie urządzenia i pozwala usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które zostały przypadkowo wprowadzone do urządzenia. Po przepłukaniu urządzeń wodą jonizowaną, zazwyczaj napełniamy urządzenie od dwóch do czterech objętości urządzenia rozcieńczonym roztworem neutravain.

Nutt travain zareaguje z GMBS, który jest unieruchomiony na powierzchni za pomocą dowolnych środków pierwotnych znajdujących się w Nutt travain. Proces ten może zachodzić w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Zazwyczaj umieszczam urządzenia w chłodni w temperaturze 4 °C przez noc.

Zanim jednak dodamy przeciwciało, chcemy wypłukać wszelki nieprzywiązany do powierzchni Aden znajdujący się w roztworze. Robimy to, przepuszczając 1% roztwór BSA rozcieńczony w PBS. Ponieważ chipy te będą wykorzystywane do dalszych analiz genomicznych, wszystkie używane przez nas roztwory są wolne od RNA.

Zazwyczaj płuczemy urządzenie czterema do pięciu objętości roztworu 1% BSA. Następnie dodajemy przeciwciało. Przeciwciałem zastosowanym w tym doświadczeniu jest CD 66 B oraz przeciwciała specyficzne dla granulocytów w krwi pełnej.

Stosujemy stężenie od 10 do 25 µg/ml i wstrzykujemy przeciwciała. Do każdego urządzenia wstrzykniemy 200 µl przeciwciał. Wykonamy dwa wstrzyknięcia po 100 µl, po jednym do każdego portu urządzenia.

Zazwyczaj wstrzykujemy 100 µL do jednego portu, odczekujemy 30 minut, a następnie wstrzykujemy kolejne 100 µL do portu przeciwległego.