Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykonanie mapowania losów oraz śledzenia linii wybranych pojedynczych komórek w embrionach ryb zebrafish. Osiąga się to poprzez chemiczne sprzęganie klatkowanej fluoresceiny z dekstranem o wysokiej masie cząsteczkowej. Następnie przygotowany dekstran z klatkowaną fluoresceiną jest wstrzykiwany metodą mikroiniekcji do embrionów zebrafish, a następnie fotoaktywowany w wybranych komórkach z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej.

Po fotoaktywacji embrionów przeprowadza się analizę immunohistochemiczną w celu wykrycia uwolnionego z klatki dekstranu fluoresceiny, aby zmapować losy aktywowanych komórek. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do określenia wkładu linii komórkowej oraz lokalizacji tkankowej fotoaktywowanych pojedynczych komórek. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak standardowa mikroskopia fluorescencyjna, jest możliwość różnicowego znakowania pojedynczych komórek w celu mapowania ich losów.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak sposób, w jaki nieróżnicowane komórki prekursorowe mogą przyczyniać się do powstania różnych typów tkanek. Demonstracja wizualna jest niezbędna, ponieważ etapy montażu zarodków i fotoaktywacji są trudne do opanowania wyłącznie na podstawie opisu tekstowego. Przed rozpoczęciem pracy należy zsyntetyzować klatkowaną flurosceninę dekstran i przechowywać ją w probówkach owiniętych folią aluminiową. Następnie należy przeprowadzić mikroiniekcję zsyntetyzowanej klatkowanej flurosceniny dekstranu do zarodków w stadium jednej do dwóch komórek.

Po osiągnięciu przez embriony odpowiedniego stopnia rozwoju, należy je powlec. Następnie powleczone embriony należy zamontować w niskotopliwym agarozie w celu fotoaktywacji. Po zestaleniu się agarozy należy uruchomić oprogramowanie LSM 510.

Umieść przezroczysty żółty filtr na drodze wiązki białego światła, a następnie wybierz opcję skanowania nowego obrazu i kliknij start expert mode. Przejdź do karty laser, włącz źródła lasera argonowego oraz Mi.Tai. Ustaw długość fali lasera Mi.Tai na 740 nm.

Następnie wybierz zakładkę config. Ustaw konfiguracje ścieżki optycznej dla jonu argonu i lasera mi tai. Następnie wybierz zakładkę scan.

Zmień obiektyw na 20×/0,8. Ustaw maksymalną prędkość skanowania, klikając max set mode method oraz liczbę na line mean i one odpowiednio w zakładce channels; odznacz wszystkie źródła laserowe z wyjątkiem mi tai. Następnie umieść miernik mocy w drodze wiązki optycznej, a potem wybierz przycisk con, aby aktywować skanowanie ciągłe.

Dostosuj procent transmisji, aż miernik mocy wskaże średnią moc laserową 47 milliwattów. Następnie zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk stop w zakładce kanałów. Odznacz źródło lasera mi tai i wybierz argonowy laser jonowy.

Następnie ponownie wybierz przycisk fast XY w zakładce kanałów, a następnie dostrój otwór pinhole, wzmocnienie detekcji (gain), wzmocnienie i offset dla lasera argonowego, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. Za pomocą kontrolera stolika odnajdź i ustaw ostrość na komórce przeznaczonej do aktywacji, a następnie kliknij przycisk stop. Używając narzędzia przycinania, obtnij aktywowaną komórkę tak, aby współczynnik przycinania (crop factor) w zakładce tryb (mode) wynosił od 50 do 70.

Następnie zatrzymaj skanowanie, wybierając przycisk stop w zakładce kanałów. Odznacz laser argonowy i wybierz laser My Tai w zakładce trybu. Ustaw prędkość skanowania na 31,46 sekund.

Następnie należy kliknąć pojedynczy przycisk, aby rozpocząć skanowanie w celu dwufotonowej aktywacji klatkowanego dekstranu fluoresceiny w wybranej komórce. Po aktywacji należy przejść do karty kanałów, odznaczyć laser mi tai i ponownie zaznaczyć laser jonowy argonowy. Następnie w sekcji trybu należy ustawić mnożnik powiększenia (zoom factor) na jeden. Następnie.

W sekcji prędkość kliknij przycisk max, aby ustawić najszybszą prędkość skanowania. Aby przejrzeć obszar fotoaktywacji, wybierz fast xy. Następnie przejdź do karty kanały, dostosuj otwór pinhole i ponownie wykonaj detekcję, sprawdzając, czy obszar fotoaktywacji nie został abladowany laserem.

Po przygotowaniu zarodków aktywowanych światłem do immunodetekcji fluoresceiny dekstranu uwalnianego z klatki (uncaged), zgodnie z protokołem opisanym w dołączonym manuskrypcie, należy przemyć zarodki sześciokrotnie w buforze PBT i dwukrotnie w buforze AP. Następnie przenieść zarodki do płytek dziewięciodołkowych z buforem AP.

Następnie odessać bufor AP i dodać N-B-T-B-C-I-P. Przerwać rozwój barwienia N-B-T-B-C-I-P poprzez odessanie roztworu N-B-T-B-C-I-P. Następnie przemyć embriony w PBT.

Następnie wyjmij zarodki i inkubuj je na rotacyjnej platformie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz płukanie w PBT jeszcze dwa razy. Na koniec zamocuj zarodki w 0,6% niskotopliwym agarozie i wykonaj obrazy fotoaktywowanych komórek, korzystając z pionowego mikroskopu złożonego.

Na rysunku przedstawiono obraz w polu jasnym (po lewej) oraz obraz fluorescencyjny (po prawej) zarodka ryby danio (*zebrafish*), do którego mikroiniekcyjnie wprowadzono klatkowaną fluoresceinę dekstran przed fotoaktywacją. Jak pokazano tutaj, zarodek został poddany fotoaktywacji w jednym z somitów wskazanym strzałką na obrazie w polu jasnym po lewej stronie, przy użyciu długości fali 740 nm, czasie skanowania 31 s oraz średniej mocy lasera 47 mW. Na rysunku po prawej można zaobserwować fluorescencję pochodzącą z uwolnionej z klatki fluoresceiny dekstranu po fotoaktywacji.

Barwienie immunologiczne nieskratowanego dekstranu fluoresceinowego przedstawiono na małym obszarze płyty bocznej mezodermy zarodka w stadium 10 somitów; aktywacja foto-chemiczna została przeprowadzona przy użyciu tych samych parametrów lasera, co na poprzedniej rycinie, z zastosowaniem procedury detekcji immunologicznej. Obszar aktywowany, wskazany tutaj strzałką, można zidentyfikować przy minimalnym barwieniu tła po zastosowaniu tej procedury.

W celu lepszej charakterystyki lokalizacji i losu znakowanych komórek można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak barwienie immunocytochemiczne dla różnych markerów specyficznych dla tkanek. Zastosowanie tej techniki otwiera przed badaczami z zakresu biologii naczyniowej możliwośćy badania pochodzenia komórek progenitorowych tętniczych i żylnych w rozwijających się embrionach rybek danio pręgowanego. Należy pamiętać, że podczas pracy z odczynnikami chemicznymi takimi jak NBT i BCIP, które mogą być niezwykle niebezpieczne, należy zawsze stosować rękawice.