Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego
26 stycznia 2013
Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.
Metoda przedstawiona w tym filmie wykorzystuje mapy przeznaczenia zarodka opus w stadium podziałów, aby zidentyfikować pojedyncze blastomery i hodować je w izolacji w celu oceny, czy losy embrionalne są determinowane przez instrukcje wewnętrzne czy zewnętrzne. Najpierw zbiera się zarodki dwukomórkowe, w których pierwsza bruzda podziałowa przecina lekko pigmentowany obszar półkuli zwierzęcej. Zarodki te są następnie hodowane; gdy osiągną stadium 16 do 32 komórek, usuwa się błonę witelinową i oddziela sąsiednie komórki od komórki wybranej. Następnie wypreparowany blastomer przenosi się do wgłębienia w studzience hodowlanej powleczonej agarosem i poddaje hodowli.
Gdy eksplant osiągnie pożądany etap rozwoju, jest on pobierany w celu oceny ekspresji genów lub białek za pomocą hybrydyzacji in situ, qPCR lub immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi, takimi jak hodowla dużych grup komórek embrionalnych lub organoidów, jest możliwość hodowli pojedynczych blastomerów embrionalnych, których los rozwojowy jest znany z badań nad śledzeniem linii komórkowych, bez konieczności dodawania czynników wzrostu lub obecności sąsiednich komórek. Dzięki temu można bezpośrednio sprawdzić, czy czynniki wewnętrzne komórki kierują danym blastomerem, aby stał się prekursorem konkretnej tkanki, czy też wymaga on sygnałów z komórek otaczających.
Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcja blastocyst oraz ich przeniesienie do studzienek hodowlanych wymaga precyzyjnych manipulacji pod mikroskopem stereoskopowym. W tym filmie wykorzystam tę metodę, aby sprawdzić, czy mRNA pochodzenia matczynego ukierunkowuje komórki w stronę losu neuronalnego, pracując pod mikroskopem sekcyjnym. Naostrz cztery zestawy pęset, używając ściernej folii Illumina.
Jedna para pęsety służy jako zapas na wypadek uszkodzenia końcówki podczas procedury; wysterylizuj w autoklawie wszystkie cztery pęsety i przechowuj je w sterylnym pojemniku. Przygotuj po 500 ml roztworów 0,1 x oraz 1,0 x zmodyfikowanej soli Bartha (MBS) i poddaj je sterylizacji przez filtrowanie. Przechowuj te roztwory przez kilka miesięcy w temperaturze od 14 do 18 °C w szklanej butelce z nakrętką. Przygotuj 2% agaru klasy elektroforetycznej w 100 ml pożywki hodowlanej 1 X. Wysterylizuj w autoklawie, aby rozpuścić agar; w razie potrzeby ponownie upłynnij agar w kuchence mikrofalowej, dopóki pozostaje on w stanie ciekłym.
Wlej około 0,5 ml na dno każdej studni sterylnej płytki hodowlanej z 24 studniami. Zapobiegnie to przywieraniu implantów do plastiku. Następnie wlej około dwóch do trzech ml na dno dwóch szalek Petriego o średnicy 360 mm i delikatnie zakręć, aby rozprowadzić płyn.
Będą one służyć jako naczynia do sekcji, a agar zapobiega przywieraniu embrionów do plastiku. Po usunięciu błon, gdy agar ostygnie i stwardnieje, należy opalić końcówkę sześciocalowej pipety pasterskiej, aż stopi się ona w kulkę. Ponownie krótko opalić kulkę, a następnie lekko dotknąć nią powierzchni agaru w dołku płytki hodowlanej.
Doprowadzi to do powstania płytkiego wgłębienia, w którym zostanie umieszczony X explan. Powtórz tę czynność dla każdej studni w płytce. Następnie napełnij każdą studnię płytki hodowlanej 1 mL sterylnej pożywki hodowlanej 1x.
Następnie należy napełnić szalkę do sekcji roztworem 0,1 XMBS, aby ułatwić oddzielenie blastomerów. Po przygotowaniu szalek do sekcji, zapłodnione jaja z usuniętymi otoczkami galaretowatymi należy przenieść do szalek Petriego o średnicy 100 mm zawierających 0,5 x pożywki hodowlanej. Jaja, których nie wykorzystano natychmiast, można hodować w temperaturze 14 °C, podczas gdy w pierwszej szalce poszukiwane są embriony w stadium dwóch komórek.
Przejrzyj embriony w pierwszej szalce Petriego za pomocą mikroskopu stereoskopowego; używając plastikowej pipety transferowej, przenieś około 10 embrionów w stadium jednej i dwóch komórek do osobnej szalki wypełnionej 0,5 x pożywką hodowlaną. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 14 °C. Zdolność tego testu do dokładnej oceny potencjału rozwojowego komórki zależy od wypreparowania odpowiedniego blastomeru w oparciu o mapy losów komórek.
Dlatego kluczowe jest wybranie embrionów o prawidłowym wzorcu pigmentacji w stadium dwóch komórek, które w konsekwencji wykazują regularne wzorce podziałów. Jak pokazano tutaj, regularne podziały często występują tylko po jednej stronie embrionu.
Zarodki te nadal mogą służyć jako dawcy, jeśli komórka dawcy pochodzi z regularnej strony. Gdy zarodki osiągną stadium dwóch komórek, należy przenieść do osobnej szalki te, w których pierwsza bruzda podziałowa przecina obszar słabo pigmentowany w półkuli zwierzęcej; należy wyselekcjonować około pięciokrotnie więcej zarodków, niż planuje się poddać sekcji. Będą one stanowić dawców eksplantu.
Pozostałe dwa embriony w stadium dwóch komórek należy trzymać w osobnej szalce obok embrionów donora przez całą procedurę, aby służyły jako kontrole rodzeństwa do określenia stadium eksplantu. Po posortowaniu i wysekcjonowaniu embrionów należy wrócić do szalek w inkubatorze, aby znaleźć więcej embrionów w stadium jednej i dwóch komórek. Ponieważ podział embrionów w stadium jednej komórki trwa około 90 minut, czynność tę można przeprowadzić do dwóch godzin po pobraniu komórek jajowych.
Aby przygotować eksplant, należy umieścić od pięciu do 10 embrionów w szalce do sekcji. Następnie ustawić pierwszy embrion tak, aby przezroczystą błonę żółtkową można było uchwycić pęsetą. Jest ona zazwyczaj niewidoczna, ale można ją chwycić w obrębie bieguna zwierzęcego, gdzie jest oddzielona wyraźną przestrzenią perivitellinową nad powierzchnią embrionu.
Używając zaostrzonej pincety w jednej ręce, chwyć blastulę przeznaczoną do sekcji w pewnej odległości od niej, aby uniknąć jej uszkodzenia. Następnie zaostrzoną pincetą w drugiej ręce chwyć błonę blisko końcówki pierwszej pincety i delikatnie pociągnij w przeciwnych kierunkach, aby oddzielić błonę. Po usunięciu błony embrion spłaszczy się.
Następnie za pomocą pęsety chwyć sąsiednią komórkę i wykorzystaj ją jako uchwyt, aby uniknąć bezpośredniego dotykania pęsetą z drugiej ręki komórki przeznaczonej do wycięcia, a pozostałe komórki sąsiednie delikatnie odsuń od wybranego blastomeru. Jeśli celem są komórki linii środkowej o tym samym przeznaczeniu, można je usunąć razem jako parę. Na koniec wycięcie komórkę służącą jako uchwyt.
Pobierz blastocystę lub parę blastocyst za pomocą sterylnej szklanej pipety pasteura, unikając pęcherzyków powietrza i nadmiernego zasysania. Umieść końcówkę pipety pasteura pod powierzchnią pożywki w dołku naczynia do hodowli typu X, a następnie delikatnie wypuść blastocystę. Powinna ona opaść do płytkiego wgłębienia pod wpływem grawitacji.
Blastulary z więcej niż jednego embrionu można połączyć w jednym eksplantacie, umieszczając je w tym samym wgłębieniu w kulturze. Procedurę tę powtarzamy sukcesywnie dla pozostałych embrionów znajdujących się w naczyniu do sekcji. Po przeniesieniu około 10 embrionów naczynie do sekcji zostanie wypełnione resztkami komórkowymi.
Gdy tak się stanie, należy przejść do kolejnej szalki do sekcji. Po zakończeniu wszystkich sekcji należy sprawdzić, czy eksplanty znajdują się w płytkich wgłębieniach. Jeśli nie, można je delikatnie przesunąć do wgłębienia za pomocą pętelki z włosa, która została wysterylizowana w 70% Ethanol i wysuszona powietrzem; implanty należy inkubować w temperaturze pokojowej na blacie przez około godzinę po ostatniej sekcji.
Usuń zanieczyszczenia wokół zagojonego eksplantatu za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura. Inkubuj płytkę z eksplantatem w temperaturze od 14 do 20 °C obok szalki Petriego zawierającej embriony kontrolne z tego samego miotu. Embriony te będą wskazywać stopień rozwoju eksplantatu blastodermy.
Po około jednej do dwóch godzinach hodowli eksplantowane blastomery podzielą się około czterech razy i odrzucą większość zanieczyszczeń pozostałych z uszkodzonych sąsiednich komórek. Po 20 godzinach utworzą one małe, zwarte kule komórkowe. Gdy embriony osiągną pożądany stopień rozwoju, należy zebrać eksplant.
Ekplanty te zachowują dobrą kondycję, nawet jeśli część komórek ulegnie dezintegracji. W związku z tym, jeśli w kulturze pojawi się zmętniała masa, należy ją zbadać za pomocą igły okularowej lub pęsety, aby sprawdzić, czy wewnątrz znajduje się zdrowy ekplant. Należy pobrać ekplant wraz z niewielką objętością roztworu hodowlanego za pomocą pipety szklanej i delikatnie przenieść go do utrwalacza lub buforu lizującego, odpowiedniego dla planowanego badania.
Dwa embriony z blasphemią grzbietową lub dwa embriony z blasphemią brzuszną wypreparowano w stadium 16 komórek i hodowano w jednym roztworze XMBS w temperaturze 14 stopni Celsjusza, aż embriony rodzeństwa osiągnęły wczesne stadia płytki neuralnej. Każdą próbkę przebadano pod kątem ekspresji zygotycznego genu płytki neuralnej Sox two za pomocą hybrydyzacji in situ, co widoczne jest jako niebieski produkt reakcji.
Wyniki tego testu wykazują, że większość grzbietowych blastomerów zwierzęcych, które są prekursorami płytki neuralnej, może autonomicznie ekspresować SOX2. Oznacza to, że proces ten zachodzi bez dodatkowego sygnałowania z innych obszarów zarodka. Blastomery, które nie wykazują ekspresji SOX2, mogły zostać błędnie zidentyfikowane w czasie sekcji.
W przeciwieństwie do nich, żadna z brzusznych blastomerów zwierzęcych, które są prekursorami brzusznego nabłonka, nie wykazuje ekspresji SOX2. Dane te wskazują, że grzbietowe blastomerów zwierzęcych posiadają wewnętrzną zdolność do tworzenia tkanki nerwowej, podczas gdy brzuszne blastomerów zwierzęcych jej nie posiadają. Niektóre z grzbietowych blastomerów przybrały również wydłużoną morfologię, co wskazuje na formowanie się grzbietowego mezodermy.
Blastomery te są również przeznaczone do tworzenia neuronów w nienaruszonym zarodku, a w hodowli eksplantacyjnej wyrażają białko markerowe neuronów, aby przetestować wpływ zmiany endogennych poziomów macierzyńskiego genu neuronalnego. mRNA Fox D5 wstrzyknięto do brzusznych blastomerów prekursorowych w stadium ośmiu komórek. Jak pokazano tutaj, większość implantów brzusznych wyrażała SOX2.
Z kolei, gdy endogenny poziom Fox D five został obniżony poprzez wstrzyknięcie antysensownych morfolino-oligonukleotydów do grzbietowych blastomerów prekursorowych w stadium ośmiu komórek, tylko nieliczne grzbietowe eksplanty wykazywały ekspresję SOX two. Eksperymenty te wskazują, że macierzinna ekspresja Fox D five odgrywa rolę w wewnętrznej zdolności grzbietowych blastomerów do nabycia losu neuronalnego. Przed przeprowadzeniem tej procedury można zastosować inne metody, takie jak wstrzykiwanie do blastomerów przeznaczonych do wycięcia mRNA w celu uzyskania funkcji (gain of function) lub antysensownych morfolino-oligonukleotydów w celu utraty funkcji (loss of function), aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.
Na przykład, jakie geny biorą udział w wewnętrznej zdolności komórek do przyjmowania określonego losu rozwojowego? Dodatkowo, można testować znane czynniki sygnałowe, dodając oczyszczone czynniki do pożywki hodowlanej. Podejście to może być również wykorzystane do transplantacji pojedynczych blastomerów w nowe miejsca w nienaruszonym zarodku.
Test ten pozwala sprawdzić, czy przeszczepiona komórka jest zdeterminowana do swojego pierwotnego losu rozwojowego; informacje te są kluczowe dla zdefiniowania mechanizmów komórkowych, dzięki którym pluripotencjalna komórka embrionalna staje się zdeterminowana do roli prekursora określonej tkanki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada wpływ dziedziczonych cząsteczek i interakcji między komórkami na los komórek embrionalnych w stadium podziału zarodków Xenopus. Dzięki wykorzystaniu map losu, naukowcy mogą hoować pojedyncze blastomery w izolacji, aby rozróżnić wkład czynników wewnętrznych i zewnętrznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
- Embriologia
Tło
- Los komórek embrionalnych może być wpłynięty zarówno przez dziedziczone cząsteczki, jak i sygnały z sąsiednich komórek.
- Rozumienie tych wpływów jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- Zarodki Xenopus służą jako model do badania wczesnych procesów rozwojowych.
- Mapy losu dostarczają wizualnej reprezentacji linii komórkowych i wyznaczania losu.
Cel badania
- Ocenić, czy los komórek embrionalnych jest wyznaczany przez czynniki wewnętrzne czy sygnały zewnętrzne.
- Hoować pojedyncze blastomery w izolacji dla szczegółowej analizy.
- Wykorzystywać badania śledzenia linii komórkowych do identyfikacji wyników rozwojowych.
Zastosowanie metod
- Zbieranie zarodków Xenopus w stadium dwukomórkowym.
- Rozcinanie sąsiednich komórek z wybranych blastomerów.
- Hodowla izolowanych blastomerów w kontrolowanym środowisku.
- Ocena ekspresji genów lub białek za pomocą technik takich jak hybrydyzacja in situ i QPCR.
Główne wyniki
- Pojedyncze blastomery mogą być hodowane bez wpływu sąsiednich komórek.
- Badanie dostarcza wglądu w czynniki wewnętrzne i zewnętrzne w wyznaczaniu losu komórkowego.
- Analizy ekspresji genów i białek ujawniają potencjał rozwojowy izolowanych komórek.
Wnioski
- Czynniki wewnętrzne w komórkach embrionalnych odgrywają znaczącą rolę w ich losie rozwojowym.
- Sygnały zewnętrzne z sąsiednich komórek są również ważne, ale mogą być izolowane dla badania.
- Ta metoda pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów wyznaczania losu komórkowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct testing of intrinsic versus extrinsic factors in cell fate determination, providing mechanistic de-risking for target validation in developmental pathways. By isolating single blastomeres with known lineage, it supports predictive confidence in early discovery by clarifying whether cellular responses are cell-autonomous or dependent on microenvironmental cues. This approach aids in distinguishing true target engagement from indirect effects, improving go/no-go decisions in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by testing whether a cell’s fate is fixed or influenced by extrinsic signals, informing target autonomy.
- Operational Value: Uses fate maps to identify and isolate single precursors with known developmental potential, enabling precise experimental design.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening readiness by establishing baseline autonomous behavior in a controlled, neighbor-free system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-cell resolution readouts (e.g., SOX2 expression via in situ hybridization or qPCR) for pathway-specific reporter assays.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible culture of isolated blastomeres in defined media without exogenous factors, reducing variability.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats, allowing parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early fate commitment mechanisms to later tissue formation, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes require cell-cell communication, helping de-risk targets dependent on niche signaling.
- Predictive Confidence: Distinguishes cell-autonomous drivers from non-autonomous effects, improving target selection for modulation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for pathways where cellular context influences phenotype expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables to determine if a target’s effect is intrinsic or requires intercellular signaling.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs (e.g., marker gene expression) suitable for high-content or multiplexed assay formats.
- Analytics: Enables statistical comparison of fate outcomes across conditions, supporting replication and cross-functional data interpretation.
- Translational Research: Connects early embryonic decisions to later developmental stages, aiding in disease-relevant system modeling when lineage conservation exists.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing genetic or pharmacological perturbations in a defined, isolated cellular context.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating intrinsic cellular properties from extrinsic microenvironmental influences.
- Operational Value: Promotes standardization through defined dissection, culture, and readout procedures, enhancing reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose efficacy depends on cell-autonomous function.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by clarifying whether a target’s modulation requires combination with microenvironment-modulating agents.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and fluorescence- or marker-guided cell identification using fate maps.
- Dependent on sterile culture infrastructure, including controlled-temperature incubators and precision pipetting tools for blastomere transfer.
- Necessitates standardization of culture conditions (e.g., MBS concentration, temperature) to ensure comparability across experiments.
- Must account for variability in embryo quality and cleavage symmetry when selecting donor cells for isolation.
- Limited to species with well-established fate maps and ex utero culture feasibility (e.g., Xenopus), restricting direct translation to mammalian systems without adaptation.
