Ładowanie przez przecięcie (cut-loading): użyteczne narzędzie do badania zakresu sprzężenia markerów złącz szczelinowych między neuronami siatkówki

Ogólnym celem poniższego eksperymentu z obciążeniem przez cięcie (cut loading) jest zbadanie stopnia sprzężenia za pomocą znacznika przez złącza szczelinowe pomiędzy neuronami w nienaruszonej siatkówce w kontrolowanych warunkach oświetlenia. Pierwszy krok polega na przecięciu siatkówek ostrym ostrzem zanurzonym w roztworze neurobiotyny, która jest cząsteczką znacznika zdolną do dyfuzji przez otwarte kanały złączy szczelinowych, ale nie przez błony komórkowe. W drugim kroku siatkówki są inkubowane w roztworze Ringera, co umożliwia dyfuzję znacznika przez otwarte kanały złączy szczelinowych.

Jeśli sprzężenie poprzez złącza szczelinowe jest słabe, fluorescencja neurobiotyny będzie ograniczona do neuronów siatkówki znajdujących się w pobliżu miejsca cięcia. W przeciwieństwie do tego, jeśli sprzężenie poprzez złącza szczelinowe jest silne, fluorescencja zostanie wykryta w neuronach siatkówki oddalonych od miejsca cięcia. Główną zaletą ładowania metodą cięcia w porównaniu z istniejącymi technikami jest łatwiejsze przeprowadzanie tej procedury w przypadku neuronów o małych ciałach komórkowych w nienaruszonej tkance siatkówki nerwowej.

Łatwiejsza jest również kontrola warunków oświetlenia podczas załadunku wycinków niż podczas badania elektrofizjologicznego pojedynczych neuronów w nienaruszonym tkankowym preparacie siatkówki. Ponieważ bodźce świetlne stosowane podczas rejestracji elektrycznej mogą same prowadzić do zmian w sprzężeniu złączy szczelinowych, technikę tę zaprezentuje dr Chu Choi, postdoc z mojego laboratorium. W tej procedurze złota rybka jest utrzymywana w stałej ciemności w ciągu dnia przez co najmniej jedną godzinę przed operacją, a wszystkie kolejne kroki, aż do utrwalenia tkanki siatkówki, są również wykonywane w ciągu dnia w stałej ciemności; głęboko znieczulamy złotą rybkę, dodając do wody w akwarium 150 mg/L metanosulfonianu.

Następnie uśmierć złotą rybkę zgodnie z wytycznymi federalnymi i uniwersyteckimi i ostrożnie usuń gałki oczne. Następnie odetnij przednią część każdej gałki ocznej. Po czym połóż kawałek papieru filtracyjnego na górnej części tylnej połowy oka, a następnie odwróć papier i oko tak, aby papier filtracyjny znalazł się pod tylną częścią oka.

Następnie delikatnie usuń tylną część oka, w tym twardówkę i nabłonek pigmentowy, z ciemnoadaptowanego złotego karasia. Przetnij nerw wzrokowy siatkówki za pomocą precyzyjnych nożyczek. Neuropatyczna siatkówka złotego karasia, zorientowana stroną fotoreceptorów do góry, powinna teraz zostać przyczepiona do papieru filtracyjnego przed enukleacją, podczas gdy ryba znajduje się pod wpływem znieczulenia w 5 mL natlenionego roztworu Ringera na bazie węglanów, z dodatkiem leku testowego lub bez niego, w każdej studzience płytki 6-dołkowej, po wycięciu nienaruszonej siatkówki neuronalnej z tylnej części oka.

Przenieść siatkówki do dołków w warunkach całkowitej ciemności. Następnie uszczelnić dołki paraformą i inkubować tkankę przez 30 minut. Bezpośrednio przed przecięciem siatkówki przygotować 100 µL roztworu znacznika, rozpuszczając 0,5% neurobiotyny w roztworze Ringera.

Następnie do szklanej szalki Petri wlej roztwór neurobiotyny. Delikatnie ostukaj papier filtracyjny, do którego przytwierdzona jest siatkówka, o ręcznik papierowy. Aby usunąć nadmiar roztworu Ringera, zanurz żyletkę w roztworze neurobiotyny i wykonaj prostopadłe cięcie promieniowe przez siatkówkę oraz papier filtracyjny.

Następnie ponownie zanurz żyletkę w roztworze neuro biotyny i przetnij siatkówkę po raz drugi. Powtórz tę czynność, wykonując do czterech nacięć na każdą siatkówkę. Na tym etapie przenieś siatkówkę do świeżego roztworu Ringera, medium z lekiem testowym lub bez niego, na 15 minut, aby umożliwić załadunek i dyfuzję.

Przemyć ją trzykrotnie świeżym roztworem Ringera lub pożywką z lekiem testowym lub bez niego, przez pięć minut każdego razu. Następnie utrwalić siatkówkę w 4%paraformaldehydzie w 0,1 M roztworze buforu fosforanowego w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie przemyć siatkówkę 0,1 M PBS przez noc w temperaturze 4 °C, umieszczając ją w lodówce do następnego dnia.

Siatkówkę inkubowano ze streptawidyną Alexa 488 (2%) w 0,1 M PBS i 0,3% Triton X 100 do stężenia końcowego 10 µg/ml przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia siatkówkę przemyto trzykrotnie 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej, każdorazowo przez 10 minut.

Oddziel siatkówkę od papieru filtracyjnego w PBS. Następnie, używając cienkiego pędzla, przymocuj siatkówkę stroną fotoreceptorów do góry na szkiełku przedmiotowym z medium montażowym vector shield. Przenieś szkiełko do konfokalnego mikroskopu skaningowego i wykonaj zdjęcia przy tym samym powiększeniu, rozdzielczości i ustawieniach dla każdego warunku eksperymentalnego, aby umożliwić porównanie wpływu różnych warunków doświadczalnych na zakres funkcjonalnego sprzężenia znacznika przez połączenia szczelinowe.

Poniżej przedstawiono zakres sprzęgania znacznika komórek fotoreceptorów w ciągu dnia w stałej ciemności w porównaniu do okresu dnia w stałej ciemności w obecności selektywnego antagonisty receptora dopaminowego D2. Należy zauważyć, że cięcie brzytwą na obu obrazach znajduje się po lewej stronie. Chociaż pojedynczy obraz może zawierać wszystkie oznakowane komórki, zaleca się zebranie stosu Z (Z stack) obszaru zainteresowania i spłaszczenie go do jednego obrazu, takiego jak ten przedstawiony.

Poniżej przedstawiono zakres sprzęgania znacznika komórek fotoreceptorów podczas sekwencyjnego przesuwania przez taki przekrój Zacka. Należy zauważyć, że cięcie brzytwą na tym obrazie znajduje się po prawej stronie. Aby ilościowo określić zakres sprzęgania znacznika w przeglądarce obrazów LSM, otwórz obraz, następnie kliknij eksport i zapisz zdjęcie jako nieskompresowany plik TIF 16-bitowy; skala powinna zostać dołączona do tego obrazu TIFF przy użyciu oprogramowania NIH ImageJ.

Zmierz intensywność fluorescencji neurobiotyny znakowanej Alexa 488 na obrazach siatkówek zamontowanych w otworach, wykonanych przy małym powiększeniu. Otwórz plik TIFF w programie Image J, a następnie narysuj linię prostą odpowiadającą paskowi skali. Następnie przejdź do menu Analyze, wybierz Set Scale i wprowadź znaną odległość oraz jednostkę długości.

Następnie kliknij OK. Teraz pomiary fluorescencji mogą być przedstawione w jednostkach skalibrowanych, takich jak milimetry. Następnie wybierz interesujący obszar, korzystając z narzędzia prostokątnego zaznaczania.

Szczyt fluorescencji powinien znajdować się przy lewej krawędzi zaznaczonego obszaru. Upewnij się, że w pobliżu prawej krawędzi nie występuje sygnał fluorescencyjny. Kliknij analyze and plot profile dla danych kontrolnych z okresu dziennego uzyskanych w stałej ciemności.

Od lewej do prawej wyświetlona jest krzywa z wykładniczym spadkiem. Następnie należy kliknąć przycisk kopiuj w oknie wyskakującym i wkleić dane do programu Excel. Obecnie dostępne są dwie kolumny: jedna przedstawiająca odległość od cięcia, a druga intensywność fluorescencji w funkcji odległości od cięcia.

W ramach porównania powyższe kroki powtarza się z danymi uzyskanymi w stałej ciemności w ciągu dnia. W obecności spit bro każdą surową wartość fluorescencji dzieli się przez maksymalną wartość fluorescencji, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji. Należy skopiować dwie kolumny odpowiadające odległości od miejsca cięcia oraz względnej intensywności fluorescencji, a następnie wkleić je do oprogramowania Origin.

Kroki te przedstawiono zarówno dla kontroli w ciągu dnia, jak i dla próbki śliny pobranej w ciągu dnia. Dane uzyskane na tym etapie dopasowuje się do wyników za pomocą funkcji wykładniczego zaniku numer jeden. Następnie porównuje się wartości stałej czasowej dla różnych warunków eksperymentalnych, stosując test T lub analizę ANOVA.

W celu porównania przedstawiono funkcje wykładnicze i analizy statystyczne danych dla grup kontrolnych w dzień, grupy z podanym pip rone w dzień oraz grupy kontrolnej w nocy. Przedstawiono przykłady zakresu sprzężenia barwnika komórek fotoreceptorów w siatkówce złotej rybki zaadaptowanej do ciemności w dzień (A), w nocy (B) oraz w dzień w obecności selektywnego antagonisty receptora dopaminowego D2, ujawnione za pomocą techniki ładowania przez przecięcie (cut loading technique). Wszystkie obrazy konfokalne zostały wykonane przy użyciu tych samych ustawień w celu porównania.

Na tym wykresie intensywność fluorescencji dla trzech warunków doświadczalnych przedstawiono jako funkcję odległości od miejsca cięcia, dopasowując dane za pomocą funkcji wykładniczej. Technika ładowania przez cięcie (cut loading) jest wykorzystywana do ilościowego określenia stopnia sprzężenia znaczników przez złącza szczelinowe poprzez obliczanie wartości stałej przestrzennej, jak pokazano tutaj dla trzech warunków doświadczalnych. Technikę ładowania przez cięcie można również wykorzystać do badania synaps elektrycznych pomiędzy innymi typami komórek w siatkówce oraz u innych gatunków.

Na przykład te dwie ryciny ilustrują, że królicze komórki poziome typu A i typu B wykazują homologiczne sprzęganie znacznika po zastosowaniu techniki ładowania przez nacięcie (cut loading) i dyfuzji neurobiotyny w warunkach adaptacji do ciemności. Wykorzystaliśmy technikę ładowania przez nacięcie, aby zbadać zakres dyfuzji znacznika przez złącza szczelinowe między pręcikami a czopkami w ciągu dnia i nocy. Ponadto technika ta może być używana do ustalenia, czy sprzęganie znacznika między innymi neuronami siatkówki jest kontrolowane przez zegar siatkówkowy i/lub przez specyficzne warunki oświetlenia i ciemności.

Można go również wykorzystać do badania sprzężenia znaczników między neuronami w innych obszarach mózgu.