Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Celem niniejszej procedury jest obserwacja dynamicznych zmian w cytoszkielecie aktynowym żywych komórek śródbłonka. Najpierw należy przeprowadzić transfekcję ludzkich komórek śródbłonka pępaż rozmroku plasmidem A GFP beta actin i hodować je do osiągnięcia konfluencji na szkiełkach podstawkowych. Następnie szkiełka należy umieścić w komorze do obrazowania żywych komórek z podgrzewanym stolikiem i infuzją fizjologicznego roztworu albuminy.

Ostatnim krokiem jest akwizycja danych z wybranego obszaru komórek poprzez rejestrację obrazów w technice time-lapse przed i po podaniu środka farmakologicznego. Analiza wykresów typu Chime za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J, może dostarczyć informacji na temat lokalnych wypustek podostawnych (podia), takich jak odległość, czas i prędkość wypustek, a także ruch włókien aktynowych w czasie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie immunofluorescencyjne, jest to, że obrazowanie żywych komórek pozwala na uwzględnienie dynamicznego charakteru aktyny i cytoszkieletu w badaniach nad mechanizmami determinującymi przepuszczalność śródbłonka.

Podczas gdy utrwalone i barwione komórki stanowią jedynie statyczne obrazy, dostarczają one niewielu informacji o dynamice aktu i cytoszkieletu przed i po traktowaniu mediatorem zapalnym. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wysterylizuj szkiełka podstawowe w 70% etanolu przez dwie minuty, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umieść każde szkiełko w 10 centymetrowej płytce hodowlanej i dodaj 300 µL ciepłego roztworu żelatyny do środka, nie dotykając krawędzi szkiełka. Po pięciu minutach odessaj ciecz.

Następnie należy zebrać konfluencyjną hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej lub VE za pomocą 0,25% trypsyny EDTA. Należy policzyć komórki i poddać je wirowaniu. Odessać jak największą ilość pożywki SUP natum przed reakcją transfekcji z wykorzystaniem zestawu VE nuclear effector kit.

Resuspenduj osady komórkowe w podstawowym roztworze efektorów jądrowych i dodaj od 0,2 do 2 µg plazmidu wektora GFP beta-aktyny. Przenieś 100 µL zawiesiny komórek do naczynia qve dla efektorów jądrowych. Kilkakrotnie stuknij w przykryte naczynie vete, aby upewnić się, że między dnem Q vet a próbką do transfekcji nie ma pęcherzyków powietrza.

Umieść Q VET w urządzeniu nuclear effector two i uruchom program A 0 3 4, przenosząc za pomocą pipety transferowej z zestawu nuclear effector kit 500 µL podgrzanego pożywki EGM two MV do qve. Następnie przenieś mieszaninę z powrotem do probówki do mikrowirówki i inkubuj przez 15 minut. Delikatnie wymieszaj raz zawiesinę przetransfekowanych VE i nanieś 300 µL zawiesiny na pokrywek szkiełko pokryte żelatyną, nie dotykając krawędzi.

Następnie inkubować od jednej do czterech godzin. Skontrolować transfektowane komórki, aby potwierdzić ich przywieranie do szkiełka podstawowego. Następnie dodać do płytki 10 ml medium E GM two MV i kontynuować inkubację w celu ekspresji GFP.

W pierwszej kolejności należy wprowadzić do grawitacyjnego systemu przepływowego roztwór soli fizjologicznej z albuminą (PSS), a następnie podłączyć go do grzałki przepływowej. Następnie należy dostosować regulator przepływu tak, aby uzyskać przepływ wynoszący około 40 mililitrów na godzinę. Po tym stop należy zatrzymać przepływ, zamykając kranik stopowy za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem.

Nałóż smar próżniowy na zewnętrzną krawędź dolnej strony kąpieli diamentowej. Następnie wyjmij z inkubatora transfektowaną hodowlę. Delikatnie unieś szkiełko nakrywkę za pomocą pęsety.

Następnie, używając chusteczki Kim wipe, wchłoń nadmiar pożywki EGM two MV z dolnego preparatu, ustawiając komórki stroną górną do góry. Umieść kąpiel diamentową nad szkiełkiem nakrywkowym, aby utworzyć komorę. Szybko umieść komorę w podgrzewaczu przedmiotu.

Zaciśnij zaciski nad komorą i pipetuj około 1 ml pożywki EGM two MV z płytki do komory. Następnie przymocuj wąż próżniowy do uchwytu po lewej stronie komory, a linię A PSS z grzałki przepływowej do kanału po prawej stronie komory. Następnie włącz próżnię i otwórz linię A PSS, aby umożliwić perfuzję kąpieli nad transfekowanymi komórkami.

Włącz również grzejnik przepływowy, ustawiając temperaturę na 37 °C. Następnie umieść sondę termistora stolika grzewczego w kąpieli wodnej przy krawędzi i włącz podgrzewanie stolika do 37 °C. Aby usunąć pozostałości pożywki EGM two MV oraz osady z sortowania, ostrożnie przetrzyj spód szkiełka nakrywnego chusteczką Kim nasączoną 70% etanolem, a następnie suchą chusteczką Kim. Pozostawytransfected komórki HU do ekwilibracji na 30 minut.

Zablokuj kursor. Skup się na wybranym obszarze hodowli komórek przeznaczonych do badania. Ustaw czas ekspozycji kamery w przedziale od 0.5 do 2 sekund, w zależności od intensywności sygnału GFP Act w komórkach.

Należy również ustawić odstępy czasu oraz czas trwania eksperymentu. Następnie, przy wyłączonym oświetleniu pomieszczenia, należy wykonać pojedyncze zdjęcie w celu oceny ustawień. Następnie należy zarejestrować serię time-lapse, monitorując powstające obrazy zgodnie z wymaganiami.

W typowym protokole należy uzyskać od 20 do 30 minut obrazów bazowych przed dodaniem czynnika testowego, a następnie przeprowadzić dodatkową akwizycję obrazów przez okres od 0,5 do czterech godzin. Na koniec, zgodnie ze szczegółami zawartymi w towarzyszącym tekście, należy ocenić odległość występu, trwałość oraz prędkość wypustek lamellipodialnych za pomocą analizy wykresów CH. W typowym eksperymencie aktyna GFP jest ekspresowana w ponad 50% przetransfekowanych komórek VE w sposób losowy.

Obrazy te, pozyskiwane raz na minutę, utrwaliły GFP aktyny w całej cytoplazmie, a także w strukturach włóknistych i w lokalnych melipodiach wysuwających się wzdłuż krawędzi komórki. Trwałość odległości oraz prędkość wypustek komórkowych są ilościowo określane na podstawie zestawów obrazów time-lapse. Przy użyciu analizy kymografu w pierwszej kolejności rysowana jest linia o szerokości jednego piksela, mniej więcej prostopadle do krawędzi komórki.

Obszar ten jest wyodrębniany z każdego obrazu z zestawu time-lapse w celu utworzenia montażu tego regionu w czasie lub wykresu chime. W ujęciu od lewej do prawej na wykresie chime wypustki są reprezentowane jako ruchy w górę na krawędzi komórki. Po nałożeniu linii na krawędź jednej z tych wypustek można zebrać dane pikselowe przypisane do tej linii, aby ilościowo określić dynamikę wypustek. Całkowita liczba wypustek na wykresie chime może służyć do oszacowania częstotliwości powstawania wypustek.

Analiza ta przedstawia ruchy włókien stresowych, które formują się w pobliżu peryferii komórki i przemieszczają się w stronę jej centrum, gdzie ostatecznie ulegają rozpadowi. Na wykresie chio włókna stresowe widoczne są jako ciągłe linie w obszarze cytoplazmy, często przemieszczające się w dół i w prawo w kierunku centrum komórki. W przypadkach, gdy włókna są trudne do dostrzeżenia na oryginalnym wykresie chio, filtr maski wyostrzającej poprawia ostrość obrazu. Linie narysowane na włóknach stresowych ułatwiają zbieranie danych o pikselach przy użyciu funkcji pomiaru. Alternatywnie, linie narysowane od początku do końca zidentyfikowanego włókna stresowego pozwalają na uzyskanie średnich danych o pikselach dla całego okresu obserwacji włókna.

Niniejsza prezentacja zademonstrowała sposób analizy danych z zestawu obrazów time-lapse za pomocą analizy wykresów w oprogramowaniu takim jak Image J. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat badania dynamiki cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na mediatory zapalne przy użyciu obrazowania żywych komórek przetransfekowanych komórek śródbłonka.