Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Ogólnym celem tej procedury jest opis prostej techniki optymalizacji barwienia i wizualizacji receptora estrogenowego alfa z wykorzystaniem przekrojów poprzecznych tętnic powierzchownych uzyskanych z mózgów samic szczura. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie z powierzchni mózgu tętnic powierzchownych zabarwionych błękitem Evansa, a następnie pocięcie ich w kriosztacie na pierścienie o grubości ośmiu mikronów po sekcjonowaniu. Przekroje poprzeczne są montowane na szkiełkach i inkubowane z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko receptorowi estrogenowemu alfa.

Następnie przekroje inkubuje się z przeciwciałem wtórnym i barwnikiem kontrastowym, stosując medium montażowe zawierające dpi. Na koniec segmenty naczyńt sieci skórnej znakowane fluorescencyjnie poddaje się obrazowaniu, a uzyskane obrazy przekształca się w obrazy 2D za pomocą oprogramowania do rozszerzonego zakresu ostrości (extended depth focus). W rezultacie, przy użyciu mikroskopu immunofluorescencyjnego Nikon z oprogramowaniem do rozszerzonego zakresu ostrości, można uzyskać wyniki obrazujące receptor estrogenowy alfa w tętniczkach sieci skórnej.

Nazywam się dr Marguerite Littleton Kearney. Dzisiaj dr Neil Farani, stażysta podoktorski w moim laboratorium, zademonstruje prostą procedurę optymalizacji wizualizacji i barwienia receptora estrogenowego alfa w próbkach skóry.

Wypreparuj tętnice z mózgu szczura, który został przepłukany barwnikiem błękitnym Evansa i przechowywany w temperaturze -70 °C. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj tętnice na powierzchni mózgu i usuń je, używając pęsety z cienkimi końcami. Ostrożnie usuń wszelkie przylegające tkanki mózgowe.

Umieść tętnice w małej probówce na lodzie. Utrwal tętnice w 2% zimnym formaldehydzie w 0,1 mol PBS przez 30 minut. Aby przygotować tętnice do cięcia, wlej medium do zatapiania na dysk mrożący ustawiony na -20 °C.

Umieść fragment tętnicy płasko na wkładce chłodzącej i poczekaj, aż zamarznie. Po całkowitym zamrożeniu ustaw tętnicę pionowo w medium do zatapiania na dysku mrożącym kriosztatu. Upewnij się, że końcówka tętnicy jest skierowana do przodu.

Przytrzymać tętnicę pęsetą, aż zostanie całkowicie zamrożona. Umieścić dysk mrożący z tętnicą w głowicy kriotomu, a następnie wyciąć pierścienie tętnicze o grubości 8 µm bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Przenieść przekroje tętnic na żelatynę chromowo-potasową.

Przygotuj preparaty na szkiełkach, używając dwóch pędzli do wyprostowania pierścieni tętniczych. Przechowuj przygotowane szkiełka w kasecie w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. Wyjmij szkiełka z lodówki i pozostaw je na blacie do osiągnięcia temperatury pokojowej.

Przemyj preparaty na szkiełkach 1 do 1,5 ml 0,1 M PBS. Po 10 minutach zlej PBS i powtórz tę czynność jeszcze dwukrotnie. Po ostatnim płukaniu PBS inkubuj szkiełka w 1 ml 50 mM chlorku amonu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby zredukować autofluorescencję, przemyj szkiełka 0,1 M PBS 3 razy, przez 10 minut każdego płukania, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie zablokuj szkiełka w roztworze PBS zawierającym 0,1% Triton X 100 oraz 1% normalnego surowicy koziej przez 30 minut, aby ograniczyć niespecyficzne wiązanie przeciwciała pierwszorzędowego.

Po blokowaniu inkubuj preparaty z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko ER alpha, rozcieńczonym do stężenia 1:500 w roztworze blokującym, przez noc w temperaturze 4°C. Wyjmij preparaty z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej. Wypłucz niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe, używając od 1 do 1,5 ml 0,1% PBS, 3 razy po 10 minut.

Przy każdym powtórzeniu inkubuj preparaty z Oregon Green, 4 88 wtórnym przeciwciałem antykróliczym w roztworze blokującym przez dwie godziny w ciemności w temperaturze pokojowej; po inkubacji przemyj preparaty 0,1 molarnym PBS 3 razy, przez 10 minut na każde przemycie, a następnie przenieś je pod wyciąg. Nanieś kroplę medium montażowego z dappy na preparaty, a następnie przykryj próbkę szkiełkiem cover slip. Nałóż bezbarwny lakier do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka cover slip i poczekaj do całkowitego wyschnięcia.

Wstaw przygotowane preparaty z barwionymi segmentami naczyń z łupiny pod mikroskop i dostrój urządzenie, aby zwizualizować fluorescencyjnie znakowane obszary zainteresowania. Wizualizacja barwionego ER alpha jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Znajdź poziom przekroju naczynia z najbardziej wyraźnymi receptorami.

Zacznij od powiększenia 100-krotnego, a następnie zwiększ powiększenie do 600-krotnego. Użyj kamery do wykonania obrazów w kanałach DPI i ZI odpowiednio dla jąder komórkowych oraz DR alfa, a następnie użyj oprogramowania, aby przekształcić wielokrotne widoki segmentów naczyń w obrazy 2D. Tutaj wyniki barwienia immunofluorescencyjnego dla ER alfa przedstawiono w kolorze zielonym, a przeciwbarwienie wykonano z użyciem DPI.

Na niebiesko w pierścieniu tętnicy wyizolowanym z mózgu samicy szczura, nałożone na siebie obrazy sugerują obecność wewnątrzjądrowego receptora estrogenowego alfa. Dzięki zastosowaniu kombinacji obrazów Zack można uzyskać obraz skupiony na immunofluorescencji ER alfa, aby uwzględnić autofluorescencję; kontrole negatywne dla przeciwciał pierwotnych i wtórnych powinny zostać przeprowadzone. Należy zwrócić uwagę na wyraźną autofluorescencję wzdłuż strony śródbłonkowej tętnicy, która nie była inkubowana z przeciwciałem wtórnym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo zrozumieć, jak izolować i oddzielać tętnice z powierzchni mózgu oraz jak przygotowywać przekroje poprzeczne o grubości ośmiu mikronów. Dodatkowo powinni Państwo zapoznać się z zastosowaniem estrogenowego receptora alfa znakowanego fluorescencyjnie oraz z wizualizacją receptorów przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego i oprogramowania Nikon extended.