Skaningowa mikroskopia konfokalna w czasie rzeczywistym i mikroendoskopia

Niniejszy materiał wideo prezentuje sposób budowy konfokalnego mikroskopu skanującego z prędkością klatkowania obrazu wideo, przy użyciu standardowych, dostępnych w handlu komponentów. Działanie konfokalnego mikroskopu skanującego opiera się na skoordynowanym ruchu dwóch luster skanujących, które przesuwają wiązkę w płaszczyźnie rastrowej; światło z pierwszego lustra jest skanowane poziomo przez pierwszy zestaw soczewek przekaźnikowych, które skupiają je z powrotem w nieruchomym punkcie na drugim lustrze skanującym. Ten sam ruch skanowania jest następnie przenoszony przez soczewki skanujące i tubusowe, co kieruje teraz rozszerzoną wiązkę światła na tylną aperturę obiektywu.

Drugie lustro, którego ruch jest wolniejszy w porównaniu z pierwszym lustrem, jednocześnie skanuje oś Y, co umożliwia skanowanie powyżej i poniżej ilustrowanej płaszczyzny i tworzy prostokątny raster na powierzchni próbki. Główną zaletą tego protokołu w stosunku do zakupu komercyjnie dostępnego mikroskopu jest niski koszt oraz możliwość dostosowania instrumentu do konkretnych potrzeb projektu obrazowania. Podczas pracy z jakimkolwiek laserem niezbędne jest podjęcie odpowiednich środków bezpieczeństwa w celu zapobieżenia urazom oczu.

Zawsze, gdy jest to możliwe, należy nosić odpowiednie okulary ochronne do pracy z laserem. Widzowie oraz badacze, którzy nie zajmują się w danej chwili ustawianiem wiązki ani pracą z nią, powinni stale nosić okulary. Należy zdjąć wszystkie błyszczące i odbijające światło zegarki oraz biżuterię.

Co najważniejsze, należy przez cały czas śledzić i kontrolować wiązkę, kończąc jej drogę za pomocą blokady wiązki lub przymocowanej wizytówki. Jest to szczególnie istotne podczas ustawiania luster, ponieważ droga wiązki może być trudna do przewidzenia. Ponadto nigdy nie należy znajdować się z oczami na wysokości drogi przebiegu wiązki.

Wyłącz laser, jeśli musisz przekroczyć płaszczyznę wiązki przed złożeniem mikroskopu. Upewnij się, że dostępny jest cały sprzęt niezbędny do konstrukcji, w tym optyczny stół pomiarowy i wsporniki 90 stopni, wszystkie lustra, soczewki i filtr dichroiczny, wraz z odpowiednimi zaciskami i elementami montażowymi, oba lustra skanujące oraz fotodetektor. Przydatne będzie również posiadanie pod ręką generatora funkcji, aby przetestować działanie skanowania i manipulować lustrami podczas ustawiania.

Zdecydowanie zaleca się również przykręcenie płyty optycznej dla zapewnienia stabilności. Konstrukcję mikroskopu należy rozpocząć od umieszczenia adaptera światłowodowego w uchwycie optycznym, a następnie ustawienia całego zestawu na środku płyty optycznej. Odpowiada to punktowi wyjścia niebieskiej wiązki, jak pokazano tutaj.

Włącz źródło światła. Za pomocą śrub regulacyjnych wstępnie ustaw wiązkę tak, aby poruszała się w linii prostej zarówno w poziomie, jak i w pionie. Umieść przysłonę przed kolimatorem światłowodowym.

Następnie dostosuj wysokość przysłony tak, aby wiązka przechodziła przez jej środek. Następnie przesuń przysłonę z dala od atora wzdłuż drogi wiązki. Sprawdź wyrównanie wiązki.

W razie potrzeby użyj dwóch śrub regulacyjnych, aby ponownie ustawić wiązkę na przysłonie. Umieść zamontowane lustro diiczne na drodze wiązki w taki sposób, aby wiązka laserowa znajdowała się w centrum lustra. Obróć uchwyt lustra, aby odbić wiązkę pod kątem około 90 stopni, upewniając się, że wysokość wiązki nie uległa zmianie.

Przymocuj lustro do stołu, dokręcając śruby w uchwycie. Następnie umieść zamontowane rezonansowe lustro galwanometryczne na drodze wiązki lasera. Należy zadbać o to, aby wiązka lasera była skierowana dokładnie w poziomy środek powierzchni lustra.

Obróć uchwyt lustra tak, aby odbić wiązkę lasera pod kątem 90 stopni. Następnie w przybliżeniu wyreguluj odbicie od lustra, aby zachować tę samą wysokość pionową wiązki lasera. W następnym kroku weź dwie przysłony i umieść je bezpośrednio przed rezonansowym galwanometrem.

Następnie, wykorzystując wiązkę lasera odbitą od rezonansowego lustra galwanometrycznego jako punkt odniesienia, ustaw ich wysokość pionową w taki sam sposób jak poprzednio. Teraz, posługując się otworami na śruby w stole optycznym jako prowadnicą wizualną, przymocuj obie przysłony w linii prostej. Wyreguluj pierwsze lustro na drodze wiązki, czyli lustro dichroiczne, aby wycentrować wiązkę na pierwszej przysłonie.

Następnie wyreguluj drugie lustro na drodze wiązki. Wykorzystaj galwanometr rezonansowy, aby wycentrować wiązkę na drugiej przysłonie. Powtarzaj regulację obu luster, aż wiązka zostanie wyrównana i przejdzie przez obie przysłony.

Należy upewnić się, że wiązka lasera odbita od rezonansowego lustra galwanometrycznego jest nadal odbijana z przybliżonego centrum lustra. Jeśli wiązka jest odchylona, należy wyregulować uchwyt kolimatora światłowodowego i powtórzyć regulację tak, aby wiązka była wycentrowana na obu otwartych przysłonach. Kolejnym krokiem jest umieszczenie dwóch soczewek przekaźnikowych, które odwzorują pierwszą stacjonarną płaszczyznę telecentryczną na drugą stacjonarną płaszczyznę telecentryczną.

W przypadku tego konkretnego mikroskopu soczewki wybrane do pierwszego przekaźnika mają tę samą ogniskową F, zatem odległość między dwoma lustrami wynosi tutaj po prostu cztery F. W tej konfiguracji F wynosi 90 mm, więc pozycja 4F znajduje się w odległości 360 mm od lustra skanującego. Aby upewnić się, że soczewki są precyzyjnie wycentrowane na drodze wiązki, należy umieścić pierwszą soczewkę na drodze wiązki i obserwować plamkę wiązki laserowej na kolejnej przysłonie w torze optycznym. Po umieszczeniu soczewki należy dostosować jej wysokość tak, aby pionowy środek wiązki znajdował się w centrum przysłony.

Następnie należy dostosować pozycję wiązki poziomej, aby wycentrować ją na przysłonie. Proces ten należy powtórzyć w przypadku drugiej soczewki. W kolejnym kroku zostanie zainstalowane lustro skanujące, a mikroskop zostanie obrócony, aby ułatwić bezpośrednie rozmieszczenie i wyrównanie elementów, które w przeciwnym razie wymagałyby regulacji w pionie.

Aby wyznaczyć dokładne położenie drugiej płaszczyzny telecentrycznej, włóż rezonansowy skaner galwanometryczny do jednostki skanującej i włącz go. Użyj wizytówki, aby prześledzić drogę wiązki skanującej przechodzącej przez dwie soczewki. Druga płaszczyzna telecentryczna znajduje się w odległości około czterech F od rezonansowego skanera galwanometrycznego i można ją zidentyfikować jako miejsce, w którym wiązka skanująca wydaje się nieruchoma.

Zaznacz ołówkiem płytkę stykową poniżej tego miejsca. Po zidentyfikowaniu płaszczyzny telecentrycznej ustaw wejście lustra skanującego na zero woltów i włącz sprzęt sterujący lustrem, aby lustro ustabilizowało się w pozycji neutralnej. Następnie ustaw standardowe skanujące lustro galilowo w dokładnym miejscu płaszczyzny tele.

Dostosuj położenie lustra w taki sposób, aby wiązka w płaszczyźnie tele uderzała dokładnie w środek lustra skanującego, a następnie dokręć uchwyt lustra. Teraz poluzuj śrubę blokującą trzymającą lustro galwanometryczne i obróć je, upewniając się, że wiązka rozchodzi się pionowo. Następnie wyłącz laser oraz elektronikę skanującą.

Odłącz światłowód oraz lustra skanujące. Następnie, używając kątowników montażowych do płyty eksperymentalnej o kącie 90 stopni, przymocuj drugą płytę eksperymentalną do pierwszej.

Na koniec ostrożnie obróć cały mikroskop tak, aby nowa płyta optyczna leżała płasko, a następnie użyj zacisku, aby zamocować mikroskop w tej pozycji. Podłącz ponownie galvo i laser, pamiętając o przywróceniu galvo do zera woltów. Pozostałą część konfiguracji, która wcześniej była ustawiona pionowo, można łatwo przeprowadzić na płaskiej płycie optycznej.

Następnie skonfigurujemy drugi zestaw soczewek przekaźnikowych, formalnie określanych jako soczewka skanująca i soczewka tubusowa. Prosimy zapoznać się z towarzyszącym protokołem pisemnym, który zawiera bardzo ważne informacje na temat wyboru odpowiedniej kombinacji soczewek. Rozpocznij od ustawienia soczewek.

W pierwszej kolejności należy rozmieścić lustra niezbędne do skierowania wiązki do obiektywu. Pierwsze duże lustro o średnicy dwóch cali należy umieścić blisko krawędzi stołu optycznego i obrócić uchwyt lustra tak, aby odbić wiązkę lasera pod kątem w przybliżeniu 90 stopni. Należy dostosować odbicie od lustra, aby zachować tę samą wysokość pionową wiązki.

Następnie umieść drugie dwucalowe lustro na przeciwległej krawędzi płyty optycznej, aby skierować wiązkę pod kątem 90 stopni, i za pomocą śrub regulacyjnych przymocuj je na stałe. Następnie ustaw dwie przysłony i w ten sam sposób dostrój oba lustra, aby wycentrować wiązkę. Potem umieść soczewkę skanującą w torze wiązki w odległości odpowiadającej jej ogniskowej od galwanometru i dostosuj jej pozycję w płaszczyźnie poziomej i pionowej.

Aby wycentrować plamkę lasera na pierwszej przysłonie między dwoma lustrami, ostrożnie umieść dużą, dwucalową soczewkę tubusową w odpowiedniej odległości od soczewki skanującej i dostosuj jej pozycję w płaszczyźnie poziomej i pionowej, aby wycentrować wiązkę na pierwszej przysłonie. W tej konfiguracji, po rozmieszczeniu wszystkich komponentów, soczewka tubusowa znajduje się w odległości 75 mm plus 300 mm.

Podłącz gal O do wyjścia standardowego generatora funkcji elektrycznych lub obwodu sterującego i ustaw napięcie szczyt-szczyt w zakresie od 1 do 3 V. Następnie rozpocznij skanowanie obu luster, używając wizytówki. Zlokalizuj wiązkę lasera w płaszczyźnie stacjonarnej, 300 mm za soczewką tubusową.

Umieść obiektyw na drodze wiązki, dbając o to, aby tylna apertura obiektywu znajdowała się jak najbliżej płaszczyzny stacjonarnej. Przygotuj stolik z próbką, upewniając się, że uchwyt przesuwny w osi Z nie uderza w uchwyt obiektywu podczas przemieszczania się w całym zakresie ruchu. Aby skonfigurować układ konfokalny, otwór pinhole oraz detektor, należy rozpocząć od odłączenia wszystkich zasilaczy i światłowodów.

Obróć zespół mikroskopu tak, aby ponownie spoczął na stole optycznym, trzymając rezonansowe lustro skanujące. Po ponownym podłączeniu światłowodu do kolimatora i standardowego lustra skanującego oraz kabli zasilających i sterujących, ustaw napięcie zero na napięciu sterującym standardowym galwanometrem skanującym, tak jak wcześniej na stoliku, a następnie umieść próbkę jasnego barwnika w kanapce między dwiema lamelkami. Następnie włącz źródło laserowe i ustaw barwnik w ostrości.

Dostosuj moc lasera, aby uzyskać jak najsilniejszą fluorescencję, wykorzystując do tego wizytówkę. Śledź emisję fluorescencji z próbki przez obiektyw, system skanujący aż do lustra dichroicznego, które odbija wiązkę lasera i przepuszcza emisję fluorescencyjną. Zlokalizuj ten sygnał fluorescencji po drugiej stronie lustra dichroicznego.

Teraz należy przyciemnić światła w pomieszczeniu. Za lustrem dichroicznym należy umieścić lustro, aby odbić emisję pod kątem 90 stopni. Następnie, używając przysłony z lustrem, należy skierować wiązkę fluorescencji tak, aby biegła jak najprościej i jak najbardziej równolegle do płyty optycznej.

Następnie zostanie skonfigurowany moduł otworu konfokalnego przy użyciu zestawu mocowań klatkowych filtru przestrzennego firmy Thor Labs. Ten schemat przedstawia konfigurację. Lustro skanujące znajduje się w płaszczyznach stacjonarnych, które są w układzie tele względem stacjonarnego obiektywu.

Pary soczewek w płaszczyźnie tylnej apertury między płaszczyznami stacjonarnymi służą do przesyłania skanowanych wiązek. Pierwsza para soczewek posiada równą ogniskową, tworząc teleskop w skali jeden do jednego. Druga para soczewek, znana formalnie jako soczewka skanująca i soczewka tubusowa, nie musi mieć równej ogniskowej i często pełni funkcję teleskopu rozszerzającego wiązkę, aby zapewnić przepełnienie tylnej apertury obiektywu.

Światło emitowane z próbki przechodzi z powrotem przez system skanujący i przechodzi przez lustro dichroiczne. Soczewka o krótkiej ogniskowej lub obiektyw skupia światło emisji w otworze konfokalnym, które następnie jest kolimowane przez soczewkę. Ostatnia soczewka skupia przefiltrowaną emisję konfokalną na fotopowielaczu.

Umieść moduł filtra przestrzennego w linii drogi wiązki emisji, dbając o to, aby centrować pierwszy uchwyt soczewki skupiającej względem wiązki emisji. W tym przypadku wybrano moduł filtra przestrzennego z otworem o średnicy 100 mikronów. Następnie zamontuj w module soczewkę o krótkiej ogniskowej i przesuwaj uchwyt translacyjny w osi Z, aż do uzyskania wyraźnej ostrości na powierzchni otworu.

Upewnij się, że cały moduł jest zorientowany wzdłuż linii prostej wyznaczonej przez wiązkę fluorescencyjną. Przymocuj moduł do płyty optycznej. Następnie, korzystając z pokręteł regulacyjnych stolika translacyjnego, dostrój obie osie, aby przeprowadzić dwuwymiarowy przeszukanie powierzchni uchwytu otworu przypinowego w celu znalezienia punktu, w którym sygnał fluorescencyjny przechodzący przez otwór przypinowy jest maksymalny.

Następnie umieść soczewkę powłokową na uchwycie klatkowym za otworem przypinowym (pinhole). Za pomocą wizytówki zlokalizuj jon fluorescencyjny przechodzący przez jednostkę konfokalną i przesuwaj soczewkę powłokową wzdłuż wsporników, aż emitowana fluorescencja będzie możliwie najlepiej skupiona. Przygotuj zespół z lampą fotopowielaczową. Umieść soczewkę o ogniskowej 50 mm na drodze wiązki emisji fluorescencyjnej i znajdź jej punkt ogniskowania.

Zaznacz tę pozycję na płyciestykowej. Teraz całkowicie wyłącz laser i ustaw fotopowielacz tak, aby jego okno znajdowało się jak najbliżej zaznaczonego punktu ogniskowania. Następnie, używając regulowanych tub soczewkowych, połącz ten zespół z soczewką skupiającą.

Owiń wszystkie odsłonięte ścieżki wiązki za otworem pinhole ciemną taśmą, a następnie włącz laser, utrzymując jego moc na bardzo niskim poziomie. Włącz fotopowielacz, uważnie odczytując jego napięcie na oscyloskopie. Wraz ze zwiększaniem natężenia lasera, zwiększaj napięcie, aż na ekranie oscyloskopu pojawi się odczyt w postaci piku i/lub przesunięcie składowej stałej (DC offset).

Potwierdź, że sygnał ten faktycznie wynika z fluorescencji, wyłączając moc lasera lub blokując drogę wiązki, aby zaobserwować zanik sygnału. Na koniec iteracyjnie ustaw otwór pinhole, aby uzyskać maksymalny sygnał na oscyloskopie. Po uprzedniej manipulacji pozycją Z soczewki skupiającej, a następnie regulacji stołu translacyjnego YZ, konfiguracja sprzętowa mikroskopu wideo jest kompletna.

Najpierw wyłączyć pomnożnik elektronów. Następnie podłączyć niestandardowe płytki sterujące lustrami oraz komputer zgodnie ze schematem przedstawionym w załączonym protokole pisemnym. System ten można dostosować do przeprowadzania konfokalnej skaningowej mikroendoskopii.

W celu zastąpienia stolika przedmiotowego uchwytem do włókien, proszę zapoznać się z towarzyszącym tekstem lub szczegółami. Gotowy pionowy konfokalny mikroskop skaningowy oraz mikroendoskop powinny wyglądać tak, jak przedstawiono tutaj. Wiązki lasera i emisji zostały narysowane w celu ułatwienia orientacji.

Podczas operacji mikroendoskopowej uchwyt światłowodu stabilizuje światłowód obrazujący podczas eksperymentów. W zależności od zastosowania uchwyt ten można łatwo zastąpić stolikiem XY. Przedstawiona tutaj platforma mikroskopu biologicznego to reprezentacyjny obraz testowy małej litery M wydrukowanej na białej wizytówce, wykonany przy użyciu karty przechwytywania obrazu w czasie rzeczywistym w celu generowania obrazów z sygnału wejściowego.Wybielono.

Biały papier zawiera fluorofory, które są łatwo pobudzane przez światło UV i niebieskie, co skutkuje jasnym tłem za ciemnymi obszarami. Aby zebrać tę emisję fluorescencyjną, wybrano filtr emisyjny z maksimum przy 515 nanometrach. Można zaobserwować niewielkie zniekształcenie obrazu, szczególnie w pobliżu bocznych krawędzi ramki obrazu.

Zniekształcenie to wynika z sinusoidalnego wzoru skanowania lustra gvo o częstotliwości ośmiu kilohertz i jest szczegółowo omówione w towarzyszącym dokumencie. Ten film przedstawia przykładowe dane w częstotliwości odświeżania wideo uzyskane poprzez skanowanie wizytówki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zbudować i wyrównać konfokalny mikroskop skanujący pracujący w częstotliwości odświeżania wideo.

Należy pamiętać, że praca z wiązką laserową może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak zdjęcie wszelkiej refleksyjnej biżuterii oraz unikanie pracy z oczami na wysokości linii wiązki.