Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Tradycyjnie badania biologiczne i kliniczne wymagające analizy mikroskopowej z rozdzielczością na poziomie komórkowym były przeprowadzane poprzez równoległe wykonanie wielu eksperymentów, z których poszczególne próbki usuwano z badania w następujących po sobie punktach czasowych w celu oceny za pomocą mikroskopii świetlnej, podczas gdy mikroskopia konfokalna, wielofotonowa i mikroskopia drugiego harmonicznego są przydatnymi technikami obrazowania in situ. Wymagana infrastruktura jest złożona i kosztowna, obejmując skaningowe systemy laserowe i zaawansowane źródła światła. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak w jeden dzień zbudować wysokorozdzielczy światłowodowy system mikroendoskopii, wykorzystując dostępne komercyjnie komponenty za kwotę poniżej 5 000 US dollars.

Platforma oferuje elastyczność w zakresie rozdzielczości obrazu, pola widzenia oraz długości fali roboczej. W pierwszej kolejności montowana jest prosta rama mikroskopu fluorescencyjnego w układzie epi, aby pomieścić źródło światła, filtry optyczne, soczewki, wiązkę światłowodową oraz kamerę CCD. Następnie instalowane są soczewki obrazujące, które tworzą powiększony obraz wiązki światłowodowej na matrycy kamery CCD.

Następnie instaluje się źródło LED z optyką oświetleniową w celu dostarczenia światła wzbudzenia fluorescencyjnego do próbki. Ostatecznie, przy użyciu zmontowanego mikroendoskopu, obrazowanie w czasie rzeczywistym pozwala na ujawnienie szczegółów na poziomie komórkowym w próbkach znakowanych fluorescencyjnie, w tym w kulturach in vitro, modelach zwierzęcych in vivo oraz u ludzi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna czy wielofotonowa, jest jej dostateczna prostota i niski koszt, dzięki czemu badacze z różnych dziedzin mogą ją szybko wdrożyć i dostosować do swoich specyficznych potrzeb.

Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości należy traktować jako konfigurację bazową, z możliwością wprowadzenia kilku modyfikacji w montażu i zastosowaniu. Wybierając komponenty do konkretnej aplikacji, należy wziąć pod uwagę zależności występujące w mikroskopii fluorescencyjnej pomiędzy stężeniem fluoroforu, oświetleniem powodującym fotobielenie, intensywnością, czułością kamery, wzmocnieniem oraz czasem ekspozycji. Platforma ta została zaprojektowana do pracy z proflawiną jako fluorescencyjnym środkiem kontrastowym, lecz może zostać skonfigurowana do pracy z innymi barwnikami fluorescencyjnymi.

Pro flavin jest jasnym barwnikiem do jąder komórkowych z maksymalną długością fali absorpcji i emisji wynoszącą odpowiednio 445 nanometrów i 515 nanometrów. Stosowanie innych środków kontrastowych będzie wymagało od użytkownika odpowiedniego doboru filtrów wzbudzenia, emisji oraz filtrów dichroicznych w celu złożenia systemu mikroendoskopu. Rozpocznij od połączenia dwóch sześciocalowych prętów klatkowych z dwoma prętami klatkowymi o długości 1,5 cala, aby utworzyć parę prętów o długości 7,5 cala. Wkręć pręty w jedną stronę jednostki lustra składanego, a następnie zainstaluj lustro o średnicy jednego cala.

Następnie wkręć cztery pręty o długości 0,5 cala w przeciwległą ściankę jednostki lustra składanego. Nasuń kostkę klatki na pręty klatki o długości 7,5 cala przez dwa dolne otwory przelotowe. Wkręć pręty o długości dwóch cali w boczną ściankę kostki klatki.

Używając adaptera z mocowaniem C na SM1, przymocuj kamerę do płyty klatki. Zamocuj płytę klatki na prętach klatki o średnicy 0,5 cala, tak aby była zlicowana z powierzchnią jednostki lustra składanego. Wybierz soczewkę tubusową o średnicy jednego cala, aby utworzyć obraz wiązki światłowodowej na kamerze.

Ogniskową obiektywu należy dobrać w taki sposób, aby obraz wiązki światłowodowej był próbkowany przez co najmniej dwa piksele. W celu obrazowania za pomocą kamery, należy włożyć obiektyw do trzymającej go tuby o długości trzech cali i zabezpieczyć go pierścieniem mocującym. Do przykręcania pierścieni mocujących w długich tubach obiektywowych pomocny jest klucz płaski.

Włóż filtr emisyjny do trzycalowej tuby obiektywu, kładąc go na pierwszym pierścieniu mocującym, a następnie dodaj kolejny pierścień, aby zabezpieczyć filtr na miejscu. Upewnij się, że orientacja filtra jest zgodna z konwencją wskazaną przez producenta filtra. Wkręć tubę obiektywu w bok kostki klatki znajdujący się najbliżej kamery CCD.

To położenie jest tutaj również przedstawione. Należy zauważyć, że na schemacie soczewka i filtr są pokazane bez trzechcalowej rury obiektywu. Dla większej przejrzystości należy podłączyć kamerę do komputera i wyświetlić obraz na ekranie.

Skieruj zestaw klatki w stronę oddalonego obiektu i przesuń kostkę klatki wzdłuż prowadnic, aż obraz obiektu stanie się ostry. Za pomocą śrubokręta dokręć cztery śruby znajdujące się po bokach kostki klatki. Śruby te po dokręceniu blokują prowadnice, utrzymując kostkę w wybranej pozycji.

Zapewni to, że soczewki tubusowe utworzą skupiony obraz wiązki światłowodowej na kamerze w połączeniu z obiektywem z korekcją w nieskończoność. Następnie włóż lustro dwukierunkowe do uchwytu i umieść je pod kątem 45 stopni w kostce klatki. Przykręć obiektyw za pomocą adaptera gwintu RMS na SM1 oraz regulowanego tubusu soczewkowego do ścianki kostki klatki przeciwległej do uchwytu soczewek tubusowych.

Następnie wkręć złączy SMA w płytkę klatkową i zamontuj ją na prętach w odległości odpowiadającej w przybliżeniu odległości roboczej obiektywu. Do otwartych boków sześcianu klatkowego dodaj płytkę podstawy oraz zaślepkę. Następnie zamontuj diodę LED na płytce klatkowej i nasuń ją na końce dwucalowych prętów.

Włóż soczewkę do tubusu soczewkowego o średnicy 0,5 cala w taki sposób, aby po wkręceniu tubusu w bok kostki klatkowej obraz diody LED wypełniał tylną aperturę obiektywu. Dodatkowo umieść filtr wzbudzenia w tubusie soczewkowym. Na tym etapie do sterowania intensywnością światła iluminacyjnego można użyć sterownika LED, a elementy przymocować za pomocą żywicy epoksydowej.

Podłącz złącze SMA dla włókna o średnicy 1030 mikronów do światłowodowego wiązki o polu widzenia 720 mikronów. Szczegółowe informacje na temat złączania światłowodów znajdują się w publikacji firmy Thorlabs, numer katalogowy FN 96: Przewodnik po złączaniu i polerowaniu włókien optycznych.

Wkręć wiązkę światłowodową z końcówkami SMA do gniazda SMA zamontowanego na prętach klatki. Skieruj dystalny koniec wiązki w stronę szerokopasmowego źródła światła; wystarczy oświetlenie fluorescencyjne. Następnie obserwuj obraz proksymalnej końcówki wiązki na kamerze CCD. Na koniec wyreguluj położenie obiektywu, wkręcając go lub wykręcając z kostki klatki.

Aż do momentu uzyskania ostrego obrazu wiązki włókien, poszczególne rdzenie powinny być wyraźnie widoczne. Rozdzielczość przestrzenną mikroendoskopu można zwiększyć, mocując mikrosoczewkę lub układ soczewek do dystalnego końca wiązki włókien. Układy optyczne te są skonfigurowane w taki sposób, że zamiast bezpośredniego przykładania końca wiązki do tkanki, obraz końcówki jest rzutowany na powierzchnię tkanki z określonym powiększeniem.

Zwiększa to częstotliwość próbkowania przestrzennego narzuconą przez światłowodowy wiązka prowadzącą światło. Stopień powiększenia soczewki GRIN odpowiada zwiększeniu rozdzielczości przestrzennej, a jednocześnie proporcjonalnemu zmniejszeniu pola widzenia. Wybierz soczewkę GRIN o powiększeniu i odległości roboczej odpowiedniej dla Twojej aplikacji.

Należy upewnić się, że średnica soczewki odpowiada średnicy wiązki włókien, z którą planuje się pracować. Montuje się wiązkę włókien oraz soczewkę GRIN na oddzielnych trójosiowych manualnych stołach pozycjonujących pod mikroskopem o małym powiększeniu lub stereomikroskopem w celu precyzyjnego wyrównania.

Następnie nanieś kroplę kleju optycznego na powierzchnię soczewki lub wiązki. Używając pozycjonerów manualnych, doprowadź oba elementy do kontaktu. Naświetl styk światłem UV z dawką zalecaną przez producenta, aby utwardzić klej.

Aby chronić soczewkę GRIN oraz powierzchnię połączenia, należy użyć krótkiego odcinka aluminiowej rurki kapilarnej w celu osłonięcia styku. Nasuń rurkę na połączenie i zabezpiecz ją kroplą żywicy epoksydowej na każdym końcu rurki, a następnie użyj rurki termokurczliwej, aby dokończyć montaż. Przed obrazowaniem mikroendoskopowym należy podać środek kontrastowy do komórek lub tkanek, które mają zostać zobrazowane, w celu obrazowania komórek i hodowli.

W pierwszej kolejności należy usunąć pożywkę za pomocą pipety. Następnie do dołka należy delikatnie nanieść roztwór proflawiny. Po krótkiej inkubacji trwającej do jednej minuty, roztwór proflawiny należy odessać pipetą i wylać.

Przepłucz komórki, dodając i usuwając świeży roztwór PBS z dołka; zamocuj dystalny koniec wiązki światłowodów w stabilnym uchwycie z manualnymi przekładniami poosiowymi X, Y, Z w celu zapewnienia stabilności. Podczas obrazowania, po aplikacji barwnika do komórek lub tkanki, umieść wiązkę światłowodów w lekkim kontakcie z próbką. Obraz z wiązki światłowodów wyświetlaj na ekranie komputera, korzystając z oprogramowania dostarczonego przez producenta kamery lub dowolnego własnego oprogramowania, które zdecydujesz się opracować.

Dostosuj czas ekspozycji oraz ustawienia wzmocnienia kamery, aby uzyskać obraz o odpowiedniej jasności. Po prawidłowym montażu mikroendoskop będzie działał jako mikroskop epifluorescencyjny przekazujący obraz poprzez spójny wiązek światłowodowy. Aby uzyskać optymalne wyniki obrazowania, należy zadbać o spełnienie trzech kluczowych warunków.

W pierwszej kolejności należy obrazować proksymalną powierzchnię wiązki światłowodowej na kamerze CCD bez rozmycia, aby uzyskać pełną rozdzielczość systemu. Tutaj przedstawiono fragment wiązki światłowodowej obrazowany przy słabej ostrości, lekkiej ostrości oraz dobrej ostrości. Optymalną ostrość uzyskuje się poprzez regulację rzeczywistej pozycji obiektywu względem powierzchni wiązki.

Po drugie, proksymalna powierzchnia wiązki włókien powinna być równomiernie oświetlona w całym jej przekroju. Jak opisano wcześniej, osiąga się to poprzez skonfigurowanie optyki oświetlenia dla oświetlenia kolistego. Przedstawiony tutaj obraz został uzyskany podczas oświetlenia jednorodnej próbki fluorescencyjnej w tej preferowanej konfiguracji.

Odpowiedni wynik przy oświetleniu krytycznym przedstawiono tutaj. Struktura diody LED jest obrazowana na czoło wiązki światłowodowej, co prowadzi do pojawienia się tego niepożądanego wzoru nałożonego na rzeczywistą strukturę próbki. Po trzecie, należy upewnić się, że zarówno czoło proksymalne, jak i dystalne wiązki światłowodowej są czyste i wolne od zarysowań oraz odprysków.

W tym przykładzie do czoła wiązki przyczepiły się zanieczyszczenia, a na obwodzie włókna widoczne jest uszkodzenie w postaci niewielkiego odprysku na godzinie piątej. Zanieczyszczenia z czoła wiązek można usunąć, czyszcząc je w taki sam sposób jak konwencjonalne złącza światłowodowe, używając papieru soczewkowego i izopropanolu lub standardowych narzędzi do czyszczenia światłowodów. 1483 komórki zostały znakowane proflawiną, a goła wiązka światłowodowa została lekko przyłożona do próbki.

Przedstawiono tutaj obrazowanie in vitro; po połączeniu wiązki z soczewką GRIN o powiększeniu 2,5x uzyskano poprawę rozdzielczości przestrzennej oraz zmniejszenie pola widzenia. Przeprowadzono obrazowanie in vivo, w którym wiązkę światłowodową o średnicy zewnętrznej 0,5 mm wprowadzono przez igłę 21G do tkanki podskórnej gruczołu piersiowego myszy, co pokazano na tym filmie; adipocyty są wyraźnie widoczne wraz z ruchem wynikającym z cyklu pracy serca. W tym przykładzie wykonano obrazowanie błony śluzowej jamy ustnej u zdrowego ochotnika z wykorzystaniem większej wiązki światłowodowej o średnicy zewnętrznej 1,5 mm.

We wszystkich przykładach jako fluorescencyjny kontrast do znakowania jąder komórkowych zastosowano pro flavin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat projektowania i montażu światłowodowego mikroendoskopu do obrazowania fluorescencyjnego komórek i tkanek in vivo.