Jednodniowy schemat przepływu pracy dla wykrywania patogenów bakteryjnych i badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe z posiewów krwi

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja oraz ocena wrażliwości na antybiotyki izolatów z posiewów krwi w krótszym czasie niż za pomocą metod konwencjonalnych. Cel ten jest osiągany poprzez uprzednią identyfikację izolatu z posiewu krwi przy użyciu nowatorskiego testu MultiPro PCR dla rybosomalnego DNA 16 s.

Następnie izolat inkubuje się z panelem antybiotyków przez sześć godzin. Kolejnym krokiem jest określenie wzrostu lub zahamowania wzrostu izolatu w obecności antybiotyku przy użyciu ilościowego testu 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R. Ostatecznie wyniki wykazują, że identyfikacja i testowanie wrażliwości na antybiotyki izolatu z posiewu krwi mogą zostać przeprowadzone szybciej dzięki temu połączeniu hodowli i PCR.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemy Phoenix lub IIC, jest brak konieczności wcześniejszego hodowania drobnoustrojów oraz możliwość uzyskania wyników identyfikacji i testów wrażliwości na antybiotyki w tym samym dniu. Procedurę zaprezentują Vandy Hanson i GID, doktoranci z naszego laboratorium. Rozcieńcz 100 µL posiewu krwi dodatniego pod kątem wzrostu drobnoustrojów w probówce reakcyjnej zawierającej 900 µL 0,9% NaCl. Następnie wiruj próbkę z prędkością 13 400 ×g przez pięć minut, aby po wirowaniu uzyskać osad bakteryjny.

Reese, zawieś osad w 100 µL sterylnej wody demineralizowanej. Przechowuj próbkę w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia. Po przygotowaniu wszystkich próbek, sporządź mieszaniny reakcyjne do real-time PCR w celu amplifikacji specyficznego 16 s rDNA z badanych bakterii.

Użyj wody demineralizowanej, aby dostosować objętość do 20 µL na reakcję. Przenieś aliquoty po 20 µL mieszaniny PCR do każdego dołka w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodaj 5 µL próbki do każdego dołka i szczelnie zamknij płytkę PCR.

Następnie przeprowadź reakcję PCR w systemie do real-time PCR A BI Prism 7, 900 HT. Aby przeanalizować wyniki po zakończeniu PCR, najpierw przejdź do karty ustawień analizy (analysis settings), aby ustawić analizę CT na 0,1. Następnie ogranicz konfigurację linii bazowej (baseline), ustawiając cykl początkowy na szósty i cykl końcowy na piętnasty. Zapisz wartość CT dla każdej próbki.

Wartość odcięcia, przy której wynik PCR uznaje się za pozytywny, można zazwyczaj ustalić na poziomie CT wynoszącym 35. W niniejszym przykładzie przedstawiono profil identyfikacyjny posiewu krwi zakażonego E. coli w dwóch mieszaninach reakcyjnych. Zastosowano uniwersalne primery do 16 s rybosomalnego DNA, które wygenerowały dwie krzywe amplifikacji o wartościach CT wynoszących 25,2 oraz 25,95.

Trzecia krzywa amplifikacji pochodzi z sondy specyficznej dla Coli. Inne sondy specyficzne nie wygenerowały wykrywalnych sygnałów. Po zidentyfikowaniu patogenu można przeprowadzić testy antybiotykowe.

Zacznij od przeniesienia pięciu mililitrów pożywki z dodatniej posiewu krwi do probówki z separatorem serum. Odwiruj próbkę z prędkością 2000 ×g przez 10 minut; po wirowaniu odrzuć nadsącz z probówki. Następnie, używając sterylnego wymazu bawełnianego, przenieś bakterie z warstwy żelu w probówce do 0,9% NaCl, aż do uzyskania roztworu o mętności odpowiadającej standardowi 0,5 McFarlanda.

Odpowiada to około 1,5 × 10⁸ jednostek tworzących kolonie na mililitr. Następnie należy rozcieńczyć zawiesinę w podwojonym stężeniu bulionu Müllera-Hintona, aby uzyskać stężenie wynoszące około 5 × 10⁵ jednostek tworzących kolonie na mililitr.

Do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej, zawierającej już 50 µL wybranych antybiotyków na dołek, nanieś 50 µL zawiesiny. Pamiętaj o uwzględnieniu pozytywnych kontroli wzrostu dla każdej próbki, używając dołków z wodą zamiast antybiotyków. Po zakończeniu procesu przykryj płytkę.

Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez sześć godzin, aby umożliwić wzrost bakterii. Pamiętaj, aby przechowywać alikwot zawiesiny bakteryjnej w temperaturze 4 °C jako ujemną kontrolę wzrostu. Po sześciogodzinnej inkubacji przenieś zawartość każdego dołka oraz próbkę kontrolną ujemną do oddzielnych sterylnych probówek.

Po pięciominutowym wirowaniu z prędkością 16 000 ×g, należy odpiąć 80 µL nadsączu i zawiesić osad w 80 µL sterylnej wody zdemineralizowanej. Przed zastosowaniem w badaniu real-time PCR dla 16 s rDNA, próbki należy rozcieńczyć w wodzie w stosunku 1:10.

Przygotować mieszaninę PCR, wykorzystując IQ cyber green super mix oraz startery do 16 s ribosomal DNA, a następnie nanieść 20 µL do każdego dołka w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodać 5 µL każdej próbki do odpowiednich dołków i szczelnie zamknąć płytkę.

Następnie przeprowadź reakcję PCR, aby przeanalizować wyniki. Najpierw oblicz wartość progową CT. Generalnie wartość progowa CT jest równa wartości CT dodatniej kontroli wzrostu plus 0,5 razy wartość CT ujemnej kontroli wzrostu minus wartość CT kontroli wzrostu.

Jednakże w przypadku piperacyliny z tazobaktamem oraz ceftazydymu w badaniach prętków Gram-ujemnych, a także amoksycyliny, oksacyliny i trimetoprimu z sulfametoksazolem w badaniach Staphylococcus aureus lub amoksycyliny w badaniach Enterococcus spp., mnożnik 0,5 należy zmniejszyć do 0,25. Podatność lub oporność szczepów w każdej próbce można określić poprzez porównanie wartości CT próbki z wartością CT odcięcia (cutoff ct).

Wartość CT powyżej wartości progowej wskazuje na wrażliwość, natomiast wartość CT poniżej wartości progowej wskazuje na oporność. Oto przykład wykresu amplifikacji wrażliwości na antybiotyki. Wcześniej zidentyfikowany szczep e coli został przetestowany pod kątem wrażliwości na kilka antybiotyków, z których każdy jest reprezentowany przez osobną krzywą.

Próbki o niskiej wartości CT to próbki, w których nastąpił wzrost w obecności antybiotyku, co wskazuje na oporność na badany antybiotyk. Przeciwnie, wysoka wartość CT reprezentuje próbkę, w której nie nastąpił wzrost, co wskazuje na wrażliwość na badany antybiotyk. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje dziewięć godzin, jeśli jest ona wykonywana prawidłowo.