Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Ogólnym celem tej procedury jest efektywne oznaczanie miana wirusa grypy w drogach oddechowych zainfekowanych myszy. Myszy są najpierw inokulowane donosowo wirusem grypy w wybranych punktach czasowych po infekcji.

Myszy są uśmiercane, a następnie pobiera się płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Następnie płyn BAL jest wykorzystywany do zakażenia komórek MDCK. Zakażone komórki można następnie barwić w celu wykrycia białek wirusowych przy użyciu specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych, a następnie przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikiem podczerwonym.

Sygnały podczerwone są odczytywane przy użyciu skanera Lycor Odyssey, a oprogramowanie Odyssey może być wykorzystane do oznaczenia miana wirusa. Dzięki zastosowaniu krzywej wzorcowej możliwe jest ilościowe określenie miana wirusa. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami są precyzyjna kwantyfikacja miana wirusa, powtarzalność oraz mała objętość próbki wymagana do przeprowadzenia tego testu.

Zastosowania tej techniki można rozszerzyć na diagnostykę i terapię różnych wirusowych chorób układu oddechowego, ponieważ po przeprowadzeniu tej procedury może ona służyć do oznaczania miana wirusa w próbkach klinicznych. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii wirusa, można przeprowadzić inne metody, np. qPCR. Podczas stosowania tej techniki ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu wirusa kontrolnego o znanym mianie po zakończeniu procesu.

Technika ta otwiera przed badaczami w dziedzinie wirusologii możliwość określania miana wirusa lub barwienia białek wirusowych w próbkach klinicznych. Po opanowaniu metody, procedura ta może zostać wykonana w ciągu 17 godzin. Wykonuje się ją w następujący sposób: najpierw należy zainfekować myszy donosowo 5 000 jednostek tworzących płytkę lub PFU wirusa grypy PR8 w 30 µL sterylnego PBS lub samym PBS jako kontrolą negatywną. W celu pobrania płynu BAL od uśpionych zwierząt, należy najpierw otworzyć jamę klatki piersiowej i za pomocą precyzyjnych sterylnych nożyczek wykonać nacięcie o długości 1 cm równolegle do tchawicy, aby ją odsłonić.

Wykonaj niewielkie nacięcie w tchawicy, wprowadź do niej 0,5 milliliters 1%BSA w PBS, a następnie delikatnie odessij płyn z płukania. Płyny z BAL przechowuj w temperaturze negative 20 degrees centigrade w celu ilościowego oznaczenia miana wirusa w płynach z płukania. Najpierw wysiej 5 million komórek MDCK w 20 milliliters kompletnego medium RPMI w kolbie T 75 i inkubuj przez noc w temperaturze 37 degrees centigrade; następnego dnia zbierz komórki i wysiej je na optyczną czarną płytkę 96-dołkową z płaskim dnem w zagęszczeniu 10 000 cells per well.

Następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C. Delikatnie odessać nadsącz i dwukrotnie przemyć komórki w pełnej, ale bezzbiżkowej pożywce DMEM zawierającej 0,2% BSA zamiast FBS. Po przemyciu komórek dodać do każdego dołka 50 µL płynu BAL lub 50 µL zawiesiny zawierającej znane stężenie wirusa.

Następnie do każdej dołki dodaje się 50 µL pożywki DMEM zawierającej trypsynę traktowaną TPCK w stężeniu 0,2 µg/mL w celu zwiększenia przylegania, wnikania i replikacji wirusa. Komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić absorpcję wirusa. Następnie do każdej kultury w dołkach dodaje się 100 µL kompletnej pożywki RPMI z dodatkiem FBS i inkubuje komórki przez noc, aby umożliwić propagację infekcji po zakończeniu inkubacji nocnej.

Przemyj komórki 100 µL 1% B-S-A-P-B-S. Po przemyciu komórek dodaj do każdej studni 100 µL 1% paraformaldehydu i inkubuj płytki przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Następnie przemyj komórki 100 µL 1% B-S-A-P-B-S na studnię i inkubuj przez kolejne 30 minut w celu blokowania. Po zablokowaniu komórek dodaj do każdej studni 50 µL przeciwciała pierwszorzędowego przeciwciała antyviralnego M two rozcieńczonego w stosunku 1:1000 i inkubuj płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby wybarwić obecne białka wirusowe. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie w 1% B-S-A-P-B-S i inkubuj je z 100 µL na studnię przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem podczerwonym w rozcieńczeniu 1:200 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po wybarwieniu komórek przemyj je trzykrotnie w sposób opisany wcześniej.

Następnie umieść płytki na szklanej platformie odczytowej skanera podczerwieni Licor Odyssey. W oprogramowaniu Licor Odyssey wybierz w czytniku ustawienie dla płytki 96-dołkowej. Zidentyfikuj dołki kontrolne ujemne (blank), a następnie zmierz fluorescencję całej płytki.

Użyj narzędzia do rysowania automatycznych kształtów, aby zaznaczyć obszar zainteresowania (ROI) w centrum dołka testowego. Wykorzystaj ROI z kontroli negatywnej, aby ustawić bazową wartość fluorescencji dla analizy, a następnie wprowadź do ROI dwa przeciwległe krzyżyki pomiarowe dostępne w oprogramowaniu Odyssey, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w obrębie dołka.

Następnie należy przeskanować płytkę, używając kanału 780 nanometrów do detekcji oraz 680 nanometrów jako długości fali referencyjnej. Po aktywacji polecenia odczytu zmierzone zostaną intensywności fluorescencji w równych odstępach w obrębie ROI, a następnie zintegrowane zostaną zebrane punkty danych.

Mnożnik odchylenia standardowego określi poziom sygnału powyżej linii bazowej, który zostanie uwzględniony w ROI; przy obliczeniach należy wybrać opcję zintegrowanej intensywności (integrated intensity), ponieważ reprezentuje ona netto objętość pikseli dla zdefiniowanych obszarów niezależnie od ich wielkości. Fluorescencja tła zostanie ilościowo określona na podstawie kontroli z pozorowaną infekcją (mock infected controls) i zostanie wykorzystana do oszacowania zintegrowanej intensywności w studzienkach testowych. Podczerwona fluorescencja z powtórzonych studzienek zawierających seryjne rozcieńczenia miareowanego wirusa służy do stworzenia krzywej wzorcowej.

Krzywą wzorcową można następnie wykorzystać do oznaczenia mian wirusa w płynie z BAL pobranym od zainfekowanych myszy. W tym eksperymencie zaobserwowano znaczący wzrost ładunku wirusowego w drugim i czwartym dniu. Po zakażeniu wirus został usunięty do 10. dnia, co przedstawiono tutaj.

Miana wirusa zmierzone za pomocą tego testu dobrze korelują z utratą masy ciała u myszy po zakażeniu. Technikę tę można zastosować również do próbek ludzkich. Przedstawiono tutaj ilościowe oznaczenie wirusa H1N1 z ludzkiego wymazu z nosa.

Granica wykrywalności w tym przypadku wynosi 10³ TCID (dawka zakaźna dla kultur tkankowych). Po obejrzeniu tego filmu zdobędą Państwo również wiedzę na temat szacowania miana wirusa grypy za pomocą testu opartego na barwniku podczerwonym. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ obsługa obrazownika Corp może być trudna, a materiał ten pomoże uprościć i zaprezentować nasze metody ilościowego oznaczania mian wirusowych na płytkach 96- lub 384-dołkowych.

I na koniec, należy pamiętać, że praca z wirusami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ochrony osobistej.