Prosty protokół Chelex dla ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyekstrahowanie DNA malarii, pasożyta oraz komara z sekcji jelita środkowego i gruczołów ślinowych preparatów. Osiąga się to poprzez najpierw precyzyjne przecięcie komara w stawie między odwłokiem a klatką piersiową, co pozwala na oddzielenie jelita środkowego od sekcji z gruczołami ślinowymi. Następnie każda z sekcji jest osobno rozcierana w wodzie dejonizowanej.

Następnie zawiesinę tkankową poddaje się działaniu ługu i przemywa, a następnie odzyskuje osad komórkowy. Na koniec osad komórkowy jest rekonstytuowany i gotowany, a następnie ekstrahuje się DNA. W efekcie można uzyskać wysokiej jakości DNA komarów i pasożytów malarii, które nadaje się do użycia jako matryca do identyfikacji anomalii, gatunków wektorów oraz genotypowania zakażeń malarią za pomocą PCR i trawienia enzymami restrykcyjnymi specyficznymi dla alleli.

Główną zaletą tej bardzo prostej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekstrakcja organiczna czy metody sortowania, jest wykorzystanie niewielkiej ilości bezpiecznych i łatwo dostępnych odczynników oraz znacznie krótszy czas przetwarzania. Aby rozpocząć sekcję komara, należy umieścić go na małym kawałku parafomy i ustawić pod mikroskopem sekcyjnym. Następnie należy przykryć go kroplą wody dejonizowanej.

Aby zmiękczyć tkankę w preparacie, należy naciąć odwłok komara dokładnie w stawie między klatką piersiową a odwłokiem, oddzielając w ten sposób głowę i klatkę piersiową od części brzusznej. Przenieś każdą z rozczłonkowanych części komara do czystej, autoklawowanej probówki do mikrocentrifugowania o pojemności 1,5 mililitra, wcześniej oznakowanej numerem identyfikacyjnym komara i nazwą części ciała. Usuń folię Parafilm i za pomocą chusteczki Kim wipe zwilżonej 70% alkoholem ostrożnie przetrzyj stolik mikroskopu przed przystąpieniem do pracy z kolejnym komarem. Aby wyekstrahować DNA komara, najpierw pipetuj 20 mikrolitrów wody dejonizowanej do probówki z próbką.

Następnie za pomocą końcówki pipety rozetrzeć zanurzony fragment komara, tworząc jednorodną zawiesinę. Do homogenatu próbki dodać 100 µL autoklawowanego roztworu XPBS z 1% saponiną i delikatnie wymieszać na wortexie. Próbkę inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Następnie wiruj przy 20 000 G przez dwie minuty i odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 100 µL 1x PBS. Następnie powtórz wirowanie.

Dodaj 75 µL sterylnej wody dejonizowanej i 25 µL 20% w/v zawiesiny żywicy Cellex 100 w wodzie dejonizowanej, a następnie delikatnie wymieszaj na wortexie w celu resuspensji osadu, używając sterylnej igły hipodermicznej o rozmiarze 23 G, wysterylizowanej w płomieniu palnika Bunsena. Przebij otwór w zakrętce probówki z próbką.

Gotuj zawiesinę próbki w bloku grzejnym przez 10 minut. Odwiruj przy 20 000 G przez jedną minutę, a następnie przenieś roztwór DNA do wcześniej oznakowanej probówki do przechowywania, aby wykorzystać go jako matrycę w reakcjach PCR w celu sprawdzenia jakości wyekstrahowanego DNA oraz amplifikacji regionu mitochondrialnego genu dehydrogenazy nikotynamidoadeninowej dinukleotydowej podjednostki czwartej stawonogów, który powinien wytworzyć fragment o długości 400 par zasad. Następnie, aby odróżnić gatunki Ananais Gambia, przeprowadź amplifikację regionu flankującego SNP w regionie odstępnika międzygenicznego, co powinno przynieść fragmenty o długości 390 par zasad dla Ananais Gambia Sens Stricto oraz 315 par zasad dla ananais api.

Następnie przeprowadzono genotypowanie polimorfizmów oporności *P. falciparum* na leki antyfolianowe. Wykonano zagnieżdżoną reakcję PCR w celu amplifikacji regionu flankującego kodony aminokwasowe 16, 51, 59, 108 i 164 w genie reduktazy dihydrofolianowej pasożyta. Następnie przeprowadzono trawienie allelospecyficzne amplikonu w celu wykrycia oporności na leki antyfolianowe.

Powiązane polimorfizmy. Reakcje sprawdzono w elektroforezie na żelu 2%AROS. Przykłady wyników testów PCR dla oceny jakości ekstraktu DNA komarów, molekularnej identyfikacji RABIS oraz genotypowania p falciparum wykazują, że uproszczona metoda Kelex daje wyniki podobne do standardowego protokołu wysalania, mimo mniejszej liczby etapów i wykorzystania mniej niż jednej czwartej czasu, przy porównywalnej jakości DNA w odpowiednich ekstraktach. Nie jest więc zaskakujące, że wskaźniki pozytywności próbek w odniesieniu do anomalii, gatunków pokrewnych z Gambii, a także wskaźniki zakażeń pasożytami nie różniły się statystycznie zgodnie z testem chi-kwadrat McNeara.

Dodanie BSA do mieszanin reakcyjnych skutkuje ogólnym wzrostem liczby wyników PCR dodatnich dzięki usunięciu inhibitorów PCR zarówno w uproszczonym protokole kelex, jak i w standardowym protokole wysalania. Wzrost ten nie był jednak istotny statystycznie, z wyjątkiem jakości DNA w ekstraktach z kelex. Po opanowaniu metody, trawienie amplikonu p falciparum specyficznymi dla alleli enzymami restrykcyjnymi umożliwia genotypowanie zakażeń malarią w jelicie środkowym i gruczołach ślinowych pod kątem alleli oporności na leki.

Przy prawidłowym wykonaniu technika ta powinna zająć około 37 minut.