Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

Niniejsza procedura przedstawia ustandaryzowane wytyczne dotyczące przeprowadzania testów agregacji zapśredniczonej przez płytki krwi dla klinicznych lub laboratoryjnych izolatów Plasmodium falciparum. W pierwszej kolejności należy pobrać krew od zakażonego pacjenta i wyizolować erytrocyty z pasożytami poprzez wirowanie, a następnie hodować i oczyszczać dojrzałe stadia aseksualne. Następnie należy pobrać krew od zdrowego dawcy w celu przygotowania i standaryzacji osocza bogatego w płytki krwi za pomocą wirowania.

Połącz płytki krwi i erytrocyty z pasożytami w celu przeprowadzenia testu aglutynacji. Wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej mogą wykazać skupiska P. falciparum pośredniczące w procesie aglutynacji płytki krwi. Technika ta została opracowana specjalnie do pomiaru fenotypu aglutynacyjnego plasmodium sra.

Izolaty kliniczne w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów. Doniesiono, że minimalne różnice w procedurach mogą zwiększać wpływ na wynik testu klastrowania kwasowego w terenie. W związku z tym konieczne było opracowanie przejrzystego i łatwego do naśladowania protokołu, dostosowanego do warunków niskozasobowych, w celu standaryzacji działań w endemicznych obszarach występowania malarii. Do probówki typu vacutainer z cytrynianem sodu należy pobrać około pięciu mililitrów krwi pełnej od gospodarza, u którego nie wystąpiła malaria, lub 2,5 mililitrów krwi od pacjentów z malarią w postaci mózgowej (CM) lub ciężkiej nie mózgowej (SM).

Odwirować krew pełną przy 250 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie przenieść mętny nadsącz do czystej probówki o pojemności 15 mililitrów. Należy pamiętać, że płytki krwi są łatwo aktywowane przez zmiany temperatury oraz wstrząsy fizyczne.

Wyznacz liczbę płytek w zawiesinie PRP za pomocą komory countingowej Neubauera i dostosuj do pożądanej stężenia za pomocą PBS, aby uzyskać osocze ubogie w płytki krwi (PPP), usuwając większość płytek z części frakcji PRP poprzez wirowanie przy 1500 g przez 10 minut. Przechowuj frakcje PRP i PPP w temperaturze 4°C przez okres do 8–10 dni. Do testu agregacji najlepiej używać świeżych płytek krwi.

Przemyj osad z obwodowych erytrocytów trzykrotnie, używając od 5 do 10 mililitrów RPMI 1640 w kolbie hodowlanej. Uzupełnij PRBC standardową pożywką do hodowli malarii oraz świeżymi, niezakażonymi erytrocytami, aby uzyskać hematokryt na poziomie 5%. Przepłucz kolby hodowlane mieszanką 92,5% azotu, 2,5% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Następnie zamknij szczelnie i inkubuj w celu uzyskania dojrzałych pasożytów z erytrocytów obwodowych pacjenta.

Inkubuj kolbę z hodowlą przez 24 do 36 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide. Nanieś około 10 do 15 µL krwi na jeden koniec matowego szkiełka przedmiotowego spoczywającego na płaskiej powierzchni. Dotknij kropli krwi krawędzią drugiego szkiełka i, trzymając je pod kątem 45 stopni, przesuń tak, aby krew równomiernie rozprzestrzeniła się wzdłuż krawędzi drugiego szkiełka.

Szybko, ale delikatnie, nie wywierając zbyt dużego nacisku na pierwszy szkiełko, równomiernie rozprowadź krew na całym szkiełku. Następnie wysusz cienką warstwę krwi powietrzem, a obszar z preparatem odwodnij metanolem przez 10 sekund. Po ponownym wysuszeniu powietrzem zanurz preparat w 2% keem.

Pozostawić na co najmniej 10 minut. Płukać obficie, aż woda będzie czysta, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Próbki należy zbadać pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu imersyjnego 100 x.

Następnie oczyścić i zsynchronizować dojrzałe PFS parum, PRBC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieść całą kulturę do czystej, sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przy 370 GS przez pięć minut.

Teraz ostrożnie odessij supernatant, nie naruszając osadu. Następnie resuspenduj komórki w taki sposób, aby jedna połowa całkowitej objętości stanowiła jello fusing. Jedna trzecia drugiej połowy to medium wolne od białek, a dwie trzecie drugiej połowy to pbcs.

Przenieś zawiesinę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i inkubuj przez 15 do 20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aż do momentu powstania wyraźnej granicy między górną a dolną warstwą. Ostrożnie przenieś górną warstwę do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml, dodaj 10 ml świeżego medium RPMI i wiruj przy 370 do 430 ×g przez pięć minut. Następnie ostrożnie odlej supernatant.

Następnie należy ocenić obecność pasożytów oraz stadium ich rozwoju za pomocą cienkiego rozmazu krwi i zbadać go pod mikroskopem świetlnym zgodnie z wcześniejszym opisem. Suspensję P RBC otrzymaną po flotacji w żelu osocza należy dostosować do stężenia 1 × 10⁸ P RBC na µL w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. P RBC zawieszamy przy hematokrycie 5% w roztworze acrydine orange lub ethidium bromide o stężeniu końcowym 20 µg/ml oraz PRP w ilości stanowiącej 10% całkowitej objętości.

Analogicznie przygotuj następujące kontrole: niezakażone czerwone krwinki oraz PRP i PRBC z dodatkiem PPP, aby ustalić rolę płytek krwi w aglutynacji PBC. Następnie przenieś zawiesinę do dwumililitrowej fiolki z nakrętką. Umieść fiolkę w delikatnym mieszaniu przez toczenie przy 10 do 12 RRP w temperaturze pokojowej, pobierając próbki w odstępach 15 do 20 minut przez łącznie 120 minut, aby sprawdzić obecność skupisk.

Nanieś 10 µL próbki na szkiełko przedmiotowe i przykryj szkiełkiem nakrywką w celu badania pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za skupisko uznaje się agregat trzech lub więcej zainfekowanych erytrocytów. W tym eksperymencie analizowano około 70% dojrzałych stadiów p FALs po wzbogaceniu metodą flotacji w żelu plazmowym; skupiska są łatwo widoczne pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Pojawiają się one jako agregaty komórek, a w świetle fluorescencyjnym jako zielone lub czerwone punkty.

Po barwieniu odpowiednio barwnikami akrydyną i pomarańczą lub bromkiem eterydyny, wielkość skupisk znacznie wzrasta do średnio ponad 15 pbcs na skupisko po 120 minutach inkubacji, przy czym niektóre skupiska zawierają liczne pbcs, których nie można było policzyć wizualnie. Częstotliwość fenotypu skupiania oblicza się jako liczbę zainfekowanych komórek występujących w skupiskach na 1000 zainfekowanych komórek policzonych w pomiarach powtórzonych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o sposobie przeprowadzania testu agregacji wywołanej przez płytki krwi w obecności Plasmodium falciparum. Należy uważać, aby nie aktywować płytek krwi gwałtownymi ruchami oraz zmianami temperatury. Test ten można również zastosować do pomiaru agregacji wywołanej przez płytki krwi w przebiegu ciężkiej malarii.