Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja wzorców ekspresji mRNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i specyficznością. Osiąga się to poprzez poddanie formalinowo utrwalonych i zatopionych w parafinie przekrojów tkankowych serii kąpieli w roztworach w celu usunięcia wosku, permeabilizacji tkanek oraz blokowania dodatnio naładowanych grup mniejszościowych w tkankach, które mogłyby generować sygnał tła. Następnie do przekrojów tkankowych wprowadza się znakowane DIG sondy RNA specyficzne dla badanego genu, a preparaty poddawane są hybrydyzacji przez noc.

Następnie preparaty na szkiełkach są przemywane, aby usunąć nieswoiście związaną sondę z sekcji, a następnie inkubowane z przeciwciałem anty-DIG. Pozwala to na wizualizację zhybrydyzowanej sondy za pomocą kolorymetrycznej reakcji chemicznej.

Wyniki wykazują ciemnoniebieski sygnał wykrywalny w mikroskopii świetlnej specyficznie w tych komórkach tkanki, w których ekspresjonowany jest badany gen. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi innymi analizami ekspresji, takimi jak R-T-P-C-R, mikromacierze lub metody Next Generation Sequencing, jest to, że przedstawiony tutaj protokół hybrydyzacji in situ ujawnia wzorzec ekspresji badanego genu w kontekście tkankowym. Metody te obejmują wiele etapów, których najlepiej uczyć się poprzez demonstracje wizualne.

Pokażemy, jak przygotowywać skrawki i zatapiać tkanki, a także omówimy kluczowe kroki w protokole hybrydyzacji AI, które są trudne do opanowania samodzielnie. Metoda zatapiania tkanek utrwalonych paraldehydem będzie się różnić w zależności od rodzaju analizowanej tkanki. Najważniejszym punktem jest tutaj zapewnienie prawidłowej orientacji próbek pod kątem późniejszego skrawania.

Jedną z metod zatapiania jest zastosowanie form i pierścieni plastikowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy ogrzać formy na płycie grzewczej o temperaturze 60 °C, a następnie wlać do nich stopioną parafinę. Następnie, używając podgrzanej pęsety, należy przenieść próbkę tkanki do każdej formy i ustawić ją w pożądanej pozycji.

Ostrożnie przenieś formę z płytki na blat i nałóż biały pierścień na formę. Dodaj kolejną porcję moli oraz wosku. Pozostaw wosk do stopniowego ostygnięcia i utwardzenia przed przystąpieniem do sekcjonowania.

Ogrzać bloki do temperatury pokojowej, a następnie przyciąć każdy z nich do kształtu trapezu, pozostawiając około jednego milimetra wosku wokół próbki. Umieścić przycięty blok w mikrotomie w taki sposób, aby dłuższa z dwóch równoległych ścian znajdowała się na dole. Ostrożnie przesunąć blok w stronę noża i upewnić się, że powierzchnia bloku jest równoległa do krawędzi tnącej noża.

O grubości od 8 do 10 mikronów. Ułóż woskowe wstęgi na nieprzywierającej powierzchni, takiej jak folia aluminiowa, i wybierz interesujące fragmenty pod stereomikroskopem. Następnie oznacz odpowiednie szkiełka przedmiotowe ołówkiem.

Nie należy używać pisaków do zaznaczania, ponieważ zostaną one usunięte podczas protokołu hybrydyzacji INI dwa. Nanieś jeden mililitr czystej wody milli Q na każdy preparat. Ostrożnie umieść wybrane skrawki na powierzchni wody w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że błyszcząca strona jest skierowana w stronę wody. Powoli przenieś preparat na podgrzewacz do szkiełek. Ustaw temperaturę w zakresie od 35 do 37 °C.

Zastosowanie tego zakresu temperatur, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych 42 °C, zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza pod skrawkami. Po pięciu minutach ostrożnie, ale jednym płynnym ruchem, odlej wodę, tak aby wstęga opadła na szkiełko przedmiotowe. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez co najmniej kilka godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C, aby tkanka dobrze przylgnęła do podłoża przed przygotowaniem skrawków tkankowych.

W przypadku hybrydyzacji in situ, preparaty są najpierw odtłuszczane i rehydratowane w celu sfinalizowania procesu odtłuszczania. Inkubuj slajdy w dwóch zmianach roztworu Histiclear przez 10 minut każda. Aby zrehydratować skrawki tkanki, przepuść slajdy przez serię roztworów etanolu o malejących stężeniach, inkubując je po 30 sekund w każdym.

Podczas obróbki proteazą, która nie jest pokazana w tym filmie, przygotuj szklaną płytkę z 0,1 molarnym roztworem trietoksyloaminy i ustaw ją na mieszadle magnetycznym w dygestorium. Bezpośrednio przed umieszczeniem metalowego statywu na szkiełka w roztworze, dodaj 1,25 mililitrów bezwodnika octowego do trietoksyloaminy, buforu i mieszadła. Dodatkowo przygotuj system zaciskowy oraz statyw do utrzymania koszyka na szkiełka.

Zmniejsz prędkość mieszania, zaklempsuj statyw z preparatami do stojaka i opuść go do roztworu, utrzymując go powyżej mieszadełka magnetycznego. Kontynuuj powolne mieszanie przez 10 minut, a następnie przepłucz preparaty w PBS i ponownie odwodnij, stosując serię stężeń etanolu. Przekroje tkanek są gotowe do hybrydyzacji.

Umieścić preparaty na czystej powierzchni i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przez 5 do 10 minut. Przygotować mieszaninę buforu do hybrydyzacji sondy, dodając zdenaturowaną sondę do 80 µL buforu do hybrydyzacji. W przypadku każdego preparatu wymieszać dokładnie za pomocą pipety, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.

Nanieś pipetą bufor do hybrydyzacji sond. Wymieszaj go na prawej krawędzi szkiełka. Stopniowo opuść szkiełko nakrywką na preparat, upewniając się, że roztwór do hybrydyzacji pokrywa wszystkie sekcje i nie ma w nim pęcherzyków powietrza.

Lekko stuknij palcem w szkiełko nakrywkowe w miejscach, w których tworzą się pęcherzyki powietrza, aby usunąć je ze wszystkich przekrojów tkanki. Nie odrywaj szkiełka nakrywkowego, ponieważ uszkodzi to przekroje. Umieść preparaty w komorze wilgotnościowej zawierającej papier Watmana zwilżony wodą UE i w znacznym stopniu pokryty param.

Szczelnie zamknij pudełko i inkubuj preparaty w żądanej temperaturze hybrydyzacji, zazwyczaj od 50 do 55 °C przez 16 do 20 godzin. Po zakończeniu protokołu hybrydyzacji ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe z preparatów. Szkiełko nakrywkowe może po prostu odpaść po ustawieniu preparatu pionowo, lecz jeśli tak się nie stanie, nie odrywaj go, aby nie uszkodzić skrawków.

Zamiast tego, zanurz preparat w ciepłym 0,2-krotnym roztworze SSC przez jedną lub dwie minuty, aby wypłukać szkiełko nakrywkę. Po usunięciu szkiełek nakrywek umieść preparaty w statywie i kilkakrotnie wypłucz w 0,2-krotnym SSC w temperaturze 55 °C. Po obróbce RNAs przenieś preparaty ze statywu na dno płaskiego plastikowego pudełka i przykryj minimalną objętością roztworu blokującego. Inkubuj preparaty w celu blokowania przez 45 minut w temperaturze pokojowej na platformie z wolnymi wstrząsami.

Następnie nanieś minimalną objętość roztworu przeciwciał bezpośrednio na każdy preparat. Inkubuj preparaty w ciemności przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji przenieś preparaty do czystego, płaskiego pudełka i przemyj je czterokrotnie minimalną objętością buforu piorącego na platformie wytrząsowej w temperaturze pokojowej.

Przepłucz preparaty raz w TBS i dwukrotnie w buforze TN, a następnie nałóż na nie świeżo przygotowany roztwór barwiący. Najpierw wlej roztwór barwiący do małego plastikowego naczynia wagowego. Następnie złącz dwa preparaty tak, aby skrawki były skierowane ku sobie.

Zanurz kanapkę w roztworze, pozwalając, aby siły kapilarne wciągnęły ciecz do środka. Osusz preparaty na chusteczce typu kim wipe. Wypełnij przestrzeń między szkiełkami roztworem barwiącym.

Ponownie, podczas wpływania roztworu może być konieczne delikatne opukiwanie preparatów w celu uniknięcia pęcherzyków powietrza; następnie należy umieścić preparaty w plastikowym pudełku i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu różnych sond i tkanek arabidopsis. Purpurowy sygnał umożliwia bezpośrednią wizualizację wzorca ekspresji badanego genu w rozdzielczości komórkowej.

Panel A przedstawia lokalizację transkryptów shoot Meli one w wegetatywnym wierzchołku pędu. Zwróć uwagę na obecność purpurowo-niebieskiego sygnału w części niedookreślonej merystemu oraz brak sygnału w otaczających liściach. Panele B-D to przekroje embrionów Arabidopsis w stadium torpedy, gdzie panel B pokazuje ekspresję covata three w nielicznych embrionalnych komórkach macierzystych.

Na zdjęciu C widoczna jest ekspresja T ML one w warstwie epidermy, a na zdjęciu D brak sygnału w przekrojach poddanych badaniu z użyciem losowego negatywnego RNA kontrolnego. Kolejne obrazy przedstawiają wyniki uzyskane przy użyciu różnych sond w tkankach kukurydzy. Panel E pokazuje lokalizację STM Humalog knotted one w rozwijającym się embrionie kukurydzy.

Zauważmy, że silny sygnał widoczny szczególnie w podłużnych przekrojach przez embrionalną łodygę i korzeń oraz wierzchołek pędu wegetatywnego wskazuje, że ARF3A wykazuje ekspresję na osiowej dolnej powierzchni liścia w panelu F, natomiast homolog ATML1, OCL4, wykazuje ekspresję specyficznie w epidermie w panelu G. Zgodnie z oczekiwaniami, w panelu H nie zaobserwowano sygnału hybrydyzacji dla sondy kontrolnej negatywnej. Przedstawiono tutaj oczekiwane wyniki poszczególnych etapów kontrolnych podczas transkrypcji sond in vitro. Sondy do hybrydyzacji in situ są sprawdzane na standardowym żelu agarozowym po transkrypcji in vitro, po traktowaniu DNazą i późniejszym oczyszczaniu reakcji transkrypcji in vitro oraz po hydrolizie węglanowej; w przypadku sond o długości powyżej 250 par zasad, takich jak sonda 1, hydroliza węglanowa spowoduje powstanie szeregu mniejszych fragmentów sondy.

Na tej rycinie przedstawiono wyniki walidacji kolorymetrycznej i ilościowej sond metodą dot blot. Rozcieńczenia od 10⁻¹ do 10⁻⁵ sondy kontrolnej o stężeniu 100 ng/µL oraz trzech nowo znakowanych sond DIG naniesiono na membranę transferową inkubowaną z przeciwciałami anty-DIG. Analiza sugeruje szacowane stężenie 100 ng/µL dla sondy 2, 10 ng/µL dla sondy 3 oraz 1 ng/µL dla sondy 4, co wskazuje, że sonda 4 prawdopodobnie nie zapewni wystarczająco silnego sygnału hybrydyzacji in situ. Na koniec, te przekroje podłużne przez wierzchołek pędu wegetatywnego z Mace stanowią porównanie między niespecyficznym sygnałem tła a panelem prawidłowo działających sond.

Na panelu A widoczny jest nieswoisty sygnał tła, podczas gdy panel B przedstawia swoisty sygnał hybrydyzacji in situ dla sondy OC five w zewnętrznej warstwie komórkowej. Po obejrzeniu tego materiału powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić wiele z trudniejszych etapów w protokołach hybrydyzacji init, aby móc określić precyzyjne wzorce ekspresji czasowo-przestrzennej wybranych genów.