Budowa niskobudżetowego systemu laserowej aksonotomii do badania regeneracji aksonów u C. elegans
15 listopada 2011
Aksonotomia laserowa z następującym po niej obrazowaniem time-lapse jest czułą metodą badania wpływu mutacji u C. elegans na regenerację aksonów. Wysokiej jakości, a jednocześnie niedrogi system ablacji laserowej można z łatwością dołączyć do większości mikroskopów. Obrazowanie time-lapse trwające 15 godzin wymaga starannego unieruchomienia nicienia.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu montażu i ustawiania systemu ablacji laserowej do badania regeneracji aksonów w organizmach C. elegans. Jest to realizowane poprzez zamontowanie polaryzatora laserowego, płytki półfalowej Thomsona, lustra odchylającego, peryskopu szynowego oraz lustra szynowego na płycie optycznej. Kolejnym krokiem procedury jest dopasowanie wiązki lasera do wiązki wychodzącej z soczewki kondensora mikroskopu.
Następnie zamontowano, wyrównano i ustawiono soczewkę ekspandera wiązki laserowej, aby wycentrować wiązkę lasera i sprawić, by była ona niedywergentna. Ostatnim krokiem procedury jest dopasowanie plamki ablacji laserowej do ogniska obrazu poprzez wprowadzenie precyzyjnych korekt. W rezultacie, przy zastosowaniu wiązki laserowej o dyfrakcyjnej granicy skupienia, możliwe jest precyzyjne przecięcie aksonów o grubości pół mikrona przy minimalnym uszkodzeniu tkanek sąsiednich, nawet w przypadku niedoskonałego wyrównania XY NC.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak lasery femtosekundowe, jest jej stosunkowo niski koszt wynoszący 15 000. Jest ona praktycznie bezobsługowa i zapewnia bardzo precyzyjne przecinanie aksonów. Chociaż metoda ta pozwala na badanie regeneracji aksonów u C. elegans, może być ona również zastosowana w innych systemach, takich jak muszki owocowe, rybki danio-pręgowane, myszy, obwodowy układ nerwowy oraz komórki in vitro.
W zasadzie każda komórka znajdująca się w odległości od 30 do 50 µm od powierzchni. Rozpocznij od rozmieszczenia komponentów na płycie montażowej, a następnie przykręć statyw peryskopu laserowego oraz podwyższone podpory szyny. System ten wykorzystuje laser klasy 3B, który może łatwo uszkodzić wzrok, dlatego prosimy o rygorystyczne przestrzeganie zasad bezpieczeństwa pracy z laserem.
Skonsultuj się z pracownikami lokalnego instytutu fizyki w celu zapoznania się z zasadami bezpiecznej pracy z laserami o wiązce otwartej. Podczas procesu pozycowania zawsze ustawiaj laser na najniższą moc. Sprawdzając obraz przez okulary, upewnij się, że wiązka lasera jest mechanicznie przesłonięta, a urządzenie jest wyłączone.
Następnie ustaw mikroskop: najpierw wyrównaj go z osią szyny. Po drugie, wyrównaj go z wiązką światła przechodzącego z soczewki kondensora mikroskopu. Po trzecie, wyrównaj oba końce szyny z wiązką kondensora, używając przymocowanej do szyny regulowanej apertury lub soczewki.
Przed kontynuacją należy użyć poziomicy oraz podnośników laboratoryjnych, aby wyregulować wysokość szyny. Należy upewnić się, że oba końce szyny są wyrównane. Następnie należy sprawdzić, czy wiązka lasera przechodzi przez gniazdo, polaryzator Thompsona i płytkę półfalową i nie uderza w ich krawędzie podczas obrotu.
Płytka półprzepuszczalna posłuży do regulacji mocy lasera po zamocowaniu wszystkich komponentów do stołu optycznego. Włącz laser, ustaw częstotliwość impulsów na tryb ciągły 100 i zredukuj moc do minimum za pomocą płytki półprzepuszczalnej. Aby zwizualizować wiązkę lasera, użyj karteczki samoprzylepnej lub papieru do soczewek.
Następnie należy skierować wiązkę lasera w górę z płyty optycznej. Należy kolejno regulować i mocować lustra w oprawach kinematycznych, zaczynając od lasera, aby doprowadzić wiązkę do lustra zamontowanego na końcu podwyższonej szyny. Po zakończeniu wiązka lasera powinna być wyrównana w przybliżeniu do środka luster, a lustra powinny być ustawione pod kątem około 45 stopni względem osi wiązki lasera, przed przystąpieniem do wyrównania wiązki lasera z wiązką światła transmitowanego mikroskopu.
Zdejmij lub otwórz wszelkie filtry ND oraz przysłony w module pośrednim. Przystępujemy teraz do najważniejszego etapu, aby zapewnić precyzyjne przecięcie aksonów bez nadmiernych uszkodzeń pobocznych. Dokonamy precyzyjnego ustawienia lasera w osiach x, y i Z przy najniższej mocy lasera, aby uzyskać najmniejszą plamkę ablacji.
Wiązka lasera oraz wiązka światła przechodzącego są widoczne jednocześnie na papierze. Na początek umieść papier w pobliżu otworu mikroskopu. Następnie przystąp do ustawiania lasera, korzystając z pokręteł wstępnych lustra na górze peryskopu oraz lustra na końcu szyny.
Umieść arkusz papieru pomiędzy wyrównaną soczewką kondensora a otwartym obrotowym uchwytem obiektywów. Kontynuuj regulację za pomocą pokręteł precyzyjnych lustra na szynie, aby wyrównać wiązkę lasera ze środkiem szerszej wiązki światła przechodzącego. Następnie unieruchom mikroskop za pomocą zacisków.
Dodatkowe kroki dotyczące oceny wyrównania lasera znajdują się w tekście manuskryptu. Należy zainstalować podwójne galileuszowe rozszerzacze wiązki, aby 33-krotnie rozszerzyć wiązkę lasera o średnicy 300 micron, w celu wypełnienia tylnej apertury obiektywu 10 millimeter. Rozpocznij od zamontowania czterech soczewek w uchwytach.
Następnie przymocuj soczewki do szyny w taki sposób, aby wszystkie znajdowały się na tej samej osi optycznej i były ustawione dokładnie prostopadle do wiązki lasera. Włącz laser i ustaw go na minimalną moc oraz tryb ciągły. Wykonaj wstępną regulację wyrównania wiązki przechodzącej przez każdą soczewkę.
Użyj papieru, aby zobaczyć wiązkę. Teraz wyłącz laser. Zastosuj przesłonę bezpieczeństwa do lasera i usuń mikroskop z drogi wiązki laserowej.
Ponownie włącz laser i zwizualizuj wiązkę na pobliskiej ścianie. Użyj precyzyjnej regulacji soczewek, aby poszerzyć wiązkę. Następnie ustaw dwa ostatnie lustra w mocowaniach kinematycznych, aby skierować wiązkę w formie koła o jednorodnej jasności do szacowanej pozycji tylnej apertury obiektywu.
Oceń rozmiar i jednorodność wiązki na papierze. Następnie ustaw wiązkę na zerową konwergencję, obserwując zmiany jej rozmiaru podczas oddalania papieru od soczewki. Wyłącz laser i zamknij migawkę mechaniczną.
Przesuń mikroskop z powrotem na drogę wiązki lasera, używając stałych zacisków do zdefiniowania prawidłowego wyrównania. Załóż zaciski po wolnej stronie mikroskopu, ale nie dokręcaj ich. Teraz włącz laser.
Zdejmij osłonę zabezpieczającą i obróć rewolwer obiektywów do pozycji otwartej, kładąc papier na stole przedmiotowym; rozszerzona i jednorodna wiązka lasera powinna być widoczna i wycentrowana względem wiązki światła przechodzącego z kondensora. Jeśli wiązki nie są wycentrowane, należy je wyrównać, poluzowując zaciski mikroskopu i ostrożnie przesuwając urządzenie. Następnie zamknij osłonę zabezpieczającą i ustaw laser w tryb wyzwalania.
Obróć obiektyw 60x na miejscu. Teraz wykonaj obraz powierzchniowych zarysowań na szkiełku obiektowym. Usuń migawkę zabezpieczającą, uruchom laser ablacyjny i dostosuj moc lasera, aby uzyskać minimalny punkt ablacji.
Plamka powinna być okrągła i znajdować się w odległości od 5 do 10 mikronów od środka obrazu, który stanowi centrum plamki ablacyjnej. Aby utrzymać plamkę w centrum i zapewnić jednorodny profil wiązki, konieczne będzie iteracyjne regulowanie lustra na szynie kinematycznej oraz górnego lustra peryskopu przy użyciu pokręteł precyzyjnych. Należy ocenić ostrość w osi Z lasera, systematycznie przesuwając ognisko w górę i w dół w krokach o wielkości jednego mikrona, wyzwalając laser ablacyjny na każdym etapie.
Jeśli wiązka jest prawidłowo rozszerzona, wyrównana i posiada odpowiednio dostrojoną zbieżność, ablacja powinna być maksymalna w punkcie ogniskowania obrazu oraz słaba lub nieobecna jeden mikron powyżej lub poniżej tego punktu. Jeśli maksymalna plamka ablacji znajduje się powyżej lub poniżej ogniskowania obrazu, należy dokonać końcowych korekt ogniskowej osi Z rozszerzonej wiązki poprzez przesuwanie soczewki L3 teleskopu Galileusza, aż ablacja laserowa będzie zgodna z ogniskowaniem obrazu. Nicienie zamocowano na dostosowanym szkiełku, a aksony usunięto za pomocą skonstruowanego systemu Laser exo somy; obrazowanie regeneracji aksonów w trybie time-lapse było bardzo stabilne.
Dzięki zastosowaniu zmotoryzowanego stolika możliwe było rutynowe i precyzyjne przecięcie oraz obrazowanie pięciu aksonów u pięciu różnych zwierząt na jednym szkiełku. Czas obrazowania aksonów stanowił czynnik ograniczający.
Około 10% eksperymentów pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości filmów time-lapse. Pozostałe eksperymenty dostarczyły dobrych danych, lecz były mniej atrakcyjne pod względem estetycznym ze względu na niewielkie, drgające ruchy nicienia, które zazwyczaj rozpoczynały się po pięciu do ośmiu godzinach unieruchomienia. Podczas przeprowadzania tej procedury zawsze istotna jest dokładna ocena wyrównania lasera w osiach x, y i Z.
Najczęstszym problemem podczas prób przecinania aksonów są uszkodzenia poboczne lub całkowita niezdolność do przecięcia aksonów, co niemal zawsze wynika z błędnego ustawienia lasera. Ten system ablacji laserowej oraz technika wizualizacji regeneracji aksonów w c Agains pozwolą na rutynowe badanie wpływu dowolnej mutacji genetycznej na regenerację aksonów. NCL Agains.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę montażu i kalibracji systemu ablacji laserowej służącego do badania regeneracji aksonów u C. elegans. Technika ta umożliwia precyzyjne przecinanie aksonów przy minimalnych uszkodzeniach pobocznych, co czyni ją wartościowym narzędziem dla badaczy w dziedzinie neuronauki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia komórki
Wstęp
- Regeneracja aksonów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów naprawy neuronów.
- Tradycyjne metody przecinania aksonów mogą powodować znaczne uszkodzenia poboczne.
- Ablacja laserowa stanowi precyzyjną alternatywę do badania regeneracji.
- C. elegans służy jako organizm modelowy do badania tych procesów.
Cel badania
- W celu zademonstrowania montażu i kalibracji systemu ablacji laserowej.
- W celu przedstawienia protokołu badania regeneracji aksonów u C. elegans.
- W celu wskazania zalet tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami.
Zastosowane metody
- Montaż komponentów laserowych na płycie optycznej.
- Ustawienie wiązki lasera w osi optycznej mikroskopu.
- Zastosowanie lasera klasy 3B do precyzyjnego przecinania aksonów.
- Obrazowanie time-lapse w celu monitorowania regeneracji aksonów przez 15 godzin.
Główne wyniki
- System ablacji laserowej umożliwia przecinanie aksonów przy minimalnych uszkodzeniach.
- Precyzyjne ustawienie jest kluczowe dla osiągnięcia optymalnych wyników.
- Metodę tę można dostosować do zastosowania w różnych organizmach modelowych.
- Obrazowanie time-lapse skutecznie rejestruje proces regeneracji.
Wnioski
- Ta technika ablacji laserowej jest ekonomicznym narzędziem w badaniach z zakresu neuronauki.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie mechanizmów regeneracji aksonów.
- Adaptacyjność tej metody sprawia, że jest ona odpowiednia dla szerokiego spektrum systemów biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niskokosztowe systemy laserowej aksonotomii umożliwiają skalowalną, ilościową analizę mechanizmów regeneracji aksonów w przezroczystych organizmach modelowych. Podejście to wspiera wczesną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w ramach portfeli badań nad neuroregeneracją, zapewniając precyzyjne i powtarzalne modele uszkodzeń. Przystępność cenowa i adaptacyjność systemu ułatwiają jego szersze zastosowanie w zespołach badawczych, przyspieszając badania nad naprawą neuronów oparte na stawianiu hipotez.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia kontrolowane uszkodzenie aksonów w celu funkcjonalnej walidacji szlaków regeneracyjnych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez minimalizację ubocznych efektów tkankowych podczas aksonotomii.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących interwencji genetycznych lub farmakologicznych w procesie naprawy neuronów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny test do ilościowego określania fenotypów regeneracji aksonów.
- Umożliwia wysokoprecyzyjną ablację przy minimalnej zmienności, co wspiera niezawodne procesy przesiewowe.
- Pozwala na integrację z obrazowaniem time-lapse, umożliwiając dynamiczną ocenę odpowiedzi regeneracyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje platformę możliwą do adaptacji w wielu systemach modelowych, zapewniając ciągłość translacyjną.
- Umożliwia prowadzenie badań porównawczych między gatunkami w celu przedklinijnej walidacji celów neuroregeneracyjnych.
- Wspiera dostosowanie wyników fenotypowych do modeli uszkodzeń neuronów istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten system laserowej aksonotomii wpisuje się w kontinuum od wczesnej fazy odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając iteracyjną walidację celu i badania mechanistyczne przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych oraz badanie szlaków w regeneracji neuronów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki odczytu odrostu aksonów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Analityka: Umożliwia precyzyjny pomiar efektów regeneracyjnych oraz statystyczne porównanie interwencji.
- Badania translacyjne: Ułatwia adaptację do różnych organizmów modelowych w celu walidacji międzygatunkowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia modułową, kosztowo efektywną platformę do wielokrotnego zastosowania w programach B&R w zakresie neurobiologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie celów naprawy neuronalnej poprzez umożliwienie precyzyjnych, ilościowych modeli urazów.
- Wartość operacyjna: Redukuje bariery techniczne i finansowe w badaniach nad regeneracją aksonów o wysokiej przepustowości.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dzięki standaryzacji oceny fenotypu regeneracyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów neuroregeneracyjnych skorygowaną o ryzyko poprzez rygorystyczną wczesną walidację.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresieyustawiania optyki oraz protokołów bezpieczeństwa pracy z laserami.
- Wymaga dostępu do podstawowej mikroskopii i infrastruktury do montażu na płytach optycznych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności warunków powodzenia urazu i obrazowania.
- Metoda jest dostosowalna do różnych przezroczystych systemów modelowych w zakresie 30–50 µm od powierzchni tkanki.
- Precyzja zależy od starannego ustawienia i regularnej kalibracji w celu uniknięcia uszkodzeń pobocznych.
