Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Niniejszy protokół przedstawia strategię in vitro dostarczania komórek macierzystych z mikrosfer chitozanowych do rusztowania z żelu kolagenowego, a następnie ich pozyskiwania i hodowli. Pierwotne komórki macierzyste adipocytów są następnie emulgowane i odzyskiwane z preparatu mikrosfer chitozanowych. Następnie komórki macierzyste wysiewa się na mikrosfery chitozanowe i hoduje w insertach do płytek hodowlanych z membraną o rozmiarze porów ośmiu mikronów, aby uzyskać CSM załadowane komórkami macierzystymi, a na koniec system dostarczania mikrosfer miesza się z trójwymiarowym rusztowaniem z żelu kolagenowego.

W ostateczności system CSM ten oferuje potencjał do zastosowania w medycynie regeneracyjnej oraz w dostarczaniu leków. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie komórek czy mikroenkapsulacja, jest zdolność komórek do przywierania do materiału nośnika i przeżycia po początkowej aplikacji. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ mikrosfery esan posiadają wrodzony ładunek statyczny.

Załadunek komórek na złoże mikrosfer będzie trudny bez ich naruszenia. Wyciąć i wypłukać tkankę tłuszczową krocza i naskórkową z owcy, następnie rozdrobnić tkankę, a potem przenieść od jednego do dwóch gramów do 25 ml HBSS zawierającego 1% FBS. Po wirowaniu zebrać swobodnie pływającą warstwę tkanki tłuszczowej do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml.

Dodać 25 mililitrów kolagenazy typu dwa i inkubować reakcję na wytrząsarce orbitalnej. Następnie ostrożnie usunąć frakcję płynną znajdującą się poniżej warstwy oleju i tkanki tłuszczowej i przefiltrować ją sekwencyjnie przez filtry z nylonowej siatki o rozmiarze 170 mikronów. Zebrać komórki metodą wirowania po dwóch przemyciach 25 mililitrami.

Po resuspensji w HBSS zawiesić osad w 30 mililitrach uzupełnionego medium do wzrostu mesen. Przenieść oczyszczone mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej do dwóch kolb hodowlanych T 75 i namnożyć preparat ASC w inkubatorze z wilgotnym powietrzem, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5% stężeniu carbon dioxide. Niniejszy protokół CSM to proces emulgacji woda w oleju, w którym wykorzystano technikę jonową.

Emulgować sześć mililitrów wodnego roztworu chitosan w 100 mililitrach mieszaniny fazy olejowej, stosując jednocześnie mieszanie mechaniczne i magnetyczne w przeciwnych kierunkach przez jedną godzinę, aż do uzyskania stabilnej emulsji olejowo-wodnej; następnie co 15 minut przez cztery godziny dodawać 1,5 mililitra 1% wodorotlenku potasu w n-oktanalu. Po zakończeniu reakcji sieciowania jonowego powoli odlać fazę olejową i niezwłocznie przenieść sfery do 100 mililitrów acetonu. Przemywać sfery acetonem aż do całkowitego usunięcia fazy olejowej.

Następnie wysusz odzyskane sfery w próżni. Poddaj je desykacji, a następnie za pomocą analizatora wielkości cząstek wyznacz średnią wielkość cząstek CSM, ich powierzchnię właściwą na miligram oraz jednostkową objętość sześcianu. Przejdź do trzykrotnego przemywania CSM sterylną wodą w celu usunięcia pozostałości soli.

Następnie wysterylizuj preparat CSM alkoholem absolutnym do zastosowania w eksperymentach komórkowych w probówce szklanej o pojemności 50 ml, wymieszaj 5 mg mikrosfer z 1 ml 0,5% roztworu TNBS i inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 40 °C. Następnie dodaj 3 ml 6N kwasu solnego i inkubuj w temperaturze 60 °C przez dwie godziny. Po ochłodzeniu próbek do temperatury pokojowej dodaj 5 ml wody dejonizowanej i 10 ml eteru etylowego.

Aby wyekstrahować wolny TNBS, należy pobrać 5 ml aliquotu fazy wodnej i ogrzewać go w kąpieli wodnej w temperaturze 40 °C przez 15 minut, aby odparować pozostały eter, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć 15 ml wody i zmierzyć absorbancję przygotowanych mikrosfer chitosanowych przy 345 nm za pomocą spektrofotometru, używając TNBS jako próbki ślepej.

Należy również zważyć chitosan wykorzystany do przygotowania CSM. Następnie obliczyć liczbę wolnych grup aminowych CSM w stosunku do całkowitej liczby grup aminowych w chitosanie. Pięć miligramów sterylizowanego CSM należy inkubować w sterylnym HBSS przez noc w celu osiągnięcia stanu równowagi.

Przenieś CSM na insert z membraną o porach 8 µm do płytki hodowlanej z 24 dołkami. Po osadzeniu się CSM ostrożnie odessij HBSS. Następnie dodaj 300 µL pożywki wzrostowej do wnętrza insertu oraz 700 µL pożywki wzrostowej na zewnątrz insertu. Resus.

Zawiesić mezenchymalne komórki macierzyste pochodzenia tłuszczowego w 200 µL pożywki wzrostowej i zasiać je na CSM wewnątrz płytki hodowlanej. Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze z 5% carbon dioxide, w warunkach wysokiej wilgotności, w temperaturze 37 °C. Przenieść załadowane komórkami macierzystymi CSM do sterylnej probówki do mikrocentryfugi, nie naruszając komórek, które migrowały do membrany wkładu.

Teraz należy usunąć pozostałą pożywkę i dodać do każdej probówki 250 µL świeżej pożywki wzrostowej. Dodać 25 µL roztworu MTT o stężeniu 5 mg/mL i inkubować przez cztery godziny. Usunąć pożywkę i dodać 250 µL dimetylosulfotlenku, a następnie wymieszać w wstrząsarce wirowej (vortex), aby rozpuścić kompleks formazanu; odwirować supernatant przy 2 700 ×g przez pięć minut.

Zmierz absorbancję supernatantu przy 570 nanometrach, stosując 630 nanometrów jako referencję. Następnie wyznacz liczbę komórek powiązanych z CSM w stosunku do wartości absorbancji uzyskanej dla znanych liczb żywych A SC. Wymieszaj pięć miligramów CSM obciążonego A SC z 7,5 miligramami na mililitr kolagenu typu I ekstrahowanego ze szczurów.

Ścięgno ogonowe, dostosować pH do 6,8 za pomocą dwóch normalnego wodorotlenku sodu i przelać na płytkę hodowlaną. Włożyć w celu fibrylacji, a następnie przenieść na płytkę 12-dołkową i inkubować przez 30 minut. Kontynuować odświeżanie pożywki dla żeli collagen A-S-C-C-S-M co drugi dzień okresu inkubacji.

Należy również monitorować uwalnianie i migrację komórek z CSM do żelu, stosując standardowe techniki mikroskopii. Poniższy przykład opisuje strategię in vitro dostarczania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z mikrosfer chitozanowych do rusztowania z żelu kolagenowego. Obrazy SEM i TEM wskazują na przygotowanie porowatych CSM o jednolitym rozmiarze.

Inkubacja mikrosfer z pierwotnymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzenia tłuszczowego wskazuje na 4 000 komórek na miligram CSM calcium am. Barwienie jednej komórki wykazuje rozprzestrzenianie się na CSM z filopodiami wnikającymi w porowate szczeliny mikrosfery. Po zmieszaniu CSM z załadowanymi komórkami z żelem kolagenowym, komórki migrują do żelu, co można obserwować w czasie.

Zastosowanie tej techniki ma bezpośrednie przełożenie na terapię rozległej i przewlekłej utraty tkanek. Ponadto schemat leczenia ten wykazuje znacznie większy potencjał ze względu na możliwość integracji z różnymi rodzajami komórek oraz biomateriałów stosowanych w leczeniu ubytków tkanek miękkich i serca na różnych poziomach. Można przypuszczać, że metoda ta pozwoli na lepsze zrozumienie procesów dostarczania komórek gospodarza.

Można je również zastosować w innych systemach, takich jak preparaty do wstrzykiwań, służące do dostarczania leków terapeutycznych oraz opracowywania systemów hybrydowych do jednoczesnego dostarczania komórek i leków terapeutycznych.