Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Ogólnym celem tego eksperymentu jest mapowanie aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opuszki węchowej myszy z wykorzystaniem wewnętrznych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencyjnych flawoprotein (obrazowanie FAS), po znieczuleniu myszy i odsłonięciu czaszki. Kość nad opuszką węchową zostaje ścieniona. Za pomocą ostrza skalpela wycina się płat kostny, który następnie usuwa się, a z cementu stomatologicznego tworzy się komorę otaczającą odsłoniętą powierzchnię opuszki węchowej.

Preparat wypełnia się ARO, a na wierzchu umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Mapy węchowe są pozyskiwane sekwencyjnie u tej samej myszy z wykorzystaniem wewnętrznych sygnałów optycznych oraz obrazowania FAS. Obrazowanie innych wywołanych aktywności w opuszce węchowej myszy przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące przestrzennego rozmieszczenia kłaczków w opuszce węchowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie 2-DG lub fMRI, jest możliwość rejestracji aktywności wywołanych zapachami z rozdzielczością przestrzenną pojedynczego kłaczka.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami napotykają na początku trudności, ponieważ zarówno umiejętności chirurgiczne, jak i instrumentalne nabywa się powoli. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, aby zwrócić uwagę na najważniejsze etapy procedur chirurgicznych i obrazowych. Ściśnij tylną łapę myszy, aby potwierdzić znieczulenie, a następnie usuń sierść ze skóry głowy za pomocą strzyżarki.

Usunąć pozostałości sierści ze skóry za pomocą sterylnych gazików nasączonych wodą destylowaną. Umieścić mysz w aparacie stereotaksycznym w taki sposób, aby pysk znajdował się w tej samej płaszczyźnie co tył głowy. Aby ustawić opuszki węchowe poziomo, należy mocno zamocować pręty uszne i nosowy, aby zapobiec przemieszczaniu się zwierzęcia.

Nałóż maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas obrazowania, a następnie zdezynfekuj obszar skóry głowy Betadyną, używając sterylnych nożyczek. Wykonaj nacięcie z tyłu głowy pomiędzy uszami, następnie rozetnij skórę po obu stronach w kierunku podstawy uszu oraz w kierunku przednio-tylnym w stronę czoła wzdłuż powiek. Zakończ usuwanie skóry głowy, przecinając skórę na pysku.

Używając paska nosowego jako prowadnicy, umieść zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą patyczka higienicznego nasączonego solą fizjologiczną delikatnie oddziel okostną z górnej części czaszki. Użyj pęsety do usunięcia pozostałych tkanek, a następnie zdrap powierzchnię czaszki skalpelem, aby zapewnić czystość preparatu, co pozwoli utrzymać obszar opuszki węchowej w stanie wilgotnym przez cały czas trwania eksperymentu.

Umieść kawałek wchłanialnej gąbki żelatynowej nasączonej wodą destylowaną na kości powyżej opuszki węchowej znajdującej się pomiędzy oczami. Usuń gąbkę żelatynową i rozpocznij od delikatnego skrobania kości ostrzem skalpela nr 10. Utrzymuj stały kąt 45 stopni między ostrzem a kością i przemieszczaj ostrze od powiek w stronę strzałkową obszaru opuszki.

Podczas procesu ścieńczania należy uważać, aby nie wywierać nacisku pionowego na kość i nie porysować powierzchni kości nad zatoką żylną. Co pięć minut należy przerwać pracę i położyć na kości nawilżoną gąbkę żelatynową, aby schłodzić preparat. Przetrzeć czaszkę gąbką w celu usunięcia resztek kości oraz pyłu, a ostrze skalpela okresowo wycierać, aby utrzymać jego czystość i ostrość.

Kontynuuj, aż pojawi się warstwa kości gąbczastej lub beleczki kostne. Gdy widoczne stanie się drobne unaczynienie opary cebulki węchowej, przestań skrobać kość i za pomocą ostrza skalpela nr 11 wyznacz obszar prostokątny, zamykając w nim cebulkę węchową. Utrzymując okno w obrębie granic zatok żylnych, kontynuuj skrobanie kości wewnątrz wyznaczonego obszaru prostokątnego.

Należy zachować szczególną ostrożność w kwestii głębokości wprowadzenia ostrza skalpela, aby uniknąć dotknięcia powierzchni opony twardej. W celu oszacowania grubości pozostałej części kości, należy ją delikatnie nacisnąć końcówką pęsety. Jeśli kość ugnie się pod wpływem nacisku, można przejść do następnego kroku.

Dodaj kroplę soli fizjologicznej i za pomocą końcówki skalpela skierowanego poziomo unieś płat kostny. Ostrożnie usuń płat pęsetą, aby uniknąć oderwania pozostałej części kości. Po odsłonięciu powierzchni opuszki węchowej sprawdź, czy nie występuje krwawienie ani nie są widoczne naczynia krwionośne.Anastomoza.

Przetrzyj obszar gąbką żelatynową nasączoną solą fizjologiczną. Aby utrzymać wilgoć opuszki węchowej, nanieś dentystyczny cement poliakrylanowy za pomocą strzykawki o rozmiarze 29G, tworząc zagłębienie na kości wokół okna czaszkowego. Nanieś kroplę wosku Aros o niskiej temperaturze topnienia na oponę twardą, a następnie umieść sterylne szkiełko nakrywkowe nad oknem czaszkowym w celu przeprowadzenia obrazowania.

Umieść ramę stereotaktyczną pod mikroskopem stereoskopowym, centrując okno czaszkowe w polu widzenia i ustawiając ostrość, aby uwidocznić naczynia włosowate. Przełącz na zielone światło o długości fali 580 nanometrów i wykonaj obraz kontrolny anatomiczny, aby sprawdzić stan preparatu podczas obrazowania. Następnie przystąp do rejestracji prób stymulacyjnych, wykorzystując obrazowanie wrodzonego sygnału optycznego przy oświetleniu 630 nanometrami lub obrazowanie sygnału autofluorescencyjnego flawoprotein przy oświetleniu 480 nanometrami. Standardowa sesja obrazowania obejmuje linię bazową trwającą od 5 do 10 sekund, podczas której podawane jest tylko powietrze, a następnie stymulację zapachem przez okres od 3 do 10 sekund, w zależności od wybranego stężenia zapachu.

Na koniec, w celu ustalenia poziomu bazowego regeneracji, rejestruje się 70 do 82 sekund podawania powietrza. Następnie, przez okno czaszkowe, obrazowane jest unaczynienie opuszki węchowej, a po nim następują wyniki próby stymulacji z użyciem h sinal jako substancji zapachowej, zarejestrowane zarówno za pomocą obrazowania iOS, jak i FAS. W obrazowaniu iOS aktywność wywołana zapachem jest przedstawiona jako ciemne obszary absorpcji; obszary aktywowane przez AL są wskazane białymi strzałkami, a obszary aktywne można zaobserwować zarówno w pojedynczych, jak i uśrednionych z wielu prób badaniach.

Po przełączeniu na obrazowanie FAS w tej samej myszy, aktywność wywołana przez OD jest teraz widoczna jako białe obszary emisji autofluorescencji wskazane czarnymi strzałkami; można ją zaobserwować zarówno w pojedynczych, jak i uśrednionych z wielu prób badaniach. Należy zauważyć, że czarne strefy absorpcji widoczne w obrazowaniu iOS oraz białe obszary emisji autofluorescencji widoczne w obrazowaniu FAS nakładają się na siebie. Ta zgodność przestrzenna potwierdza, że obie techniki umożliwiają wizualizację tych samych kłębków węchowych. Po opanowaniu obrazowania aktywności wywołanej przy użyciu sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji, cały proces może zostać zrealizowany w ciągu godziny w przypadku operacji i kilku godzin w przypadku akwizycji obrazów.

Głównymi wadami stosowania tych metod obrazowania optycznego jest fakt, że nie mogą one zostać wykorzystane do wizualizacji map węchowych u myszy poruszających się swobodnie. Ponadto, ze względu na ograniczoną penetrację fotonów w tkanki biologiczne, nie zapewniają one dostępu do brzusznych kłębków węchowych po ich rozwoju pod koniec lat dziewięćdziesiątych, co utrudnia rejestrację sygnałów wewnętrznych w systemie węchowym. Być może stanowi to drogę dla badaczy z zakresu obrazowania optycznego do zgłębienia charakterystyki specjalnej powłoki od.

Obrazowanie autofluorescencji flawoprotein w opuszce węchowej jest obiecującą techniką pozwalającą na uzyskanie nowych informacji o specjalnej otoczce OD z wykorzystaniem endogennych sygnałów optycznych.