Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Ogólnym celem niniejszego artykułu wideo jest opis techniki poddawania komórek adherentnych warunkom przepływu laminarnego oraz ocena odpowiedzi na dobrze mierzalne naprężenia ścinające płynu. Jest to realizowane poprzez wstępny montaż układu przepływowego bez komory przepływowej. Układ obejmuje zbiornik impulsu, tłumik, rurki sztywne, rurki elastyczne, czworodrożne kurki i połączone adaptery Luer, a także filtr powietrza.

Kolejnym krokiem jest napełnienie układu pożądanym płynem, na przykład pożywką komórkową w warunkach sterylnych, a następnie uruchomienie pompy w celu napełnienia tłumika pulsacji i usunięcia powietrza z przewodów. Następnie do dolnej płyty komory przepływowej wprowadza się szkiełko z osadzonymi komórkami. Ostatnim etapem procedury jest całkowity montaż układu przepływowego z wpiętą w obieg komorą przepływową.

W rezultacie można uzyskać obrazy wykazujące orientację fluorescencyjnie znakowanych komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego cieczy w przezroczystej komorze, wykorzystując mikroskop fluorescencyjny w celu zbadania funkcjonalnego zachowania komórek. Aby zbadać zachowanie komórek, często konieczne jest naśladowanie fizjologii in vivo poprzez poddawanie ich działaniu naprężenia ścinającego cieczy. Zaprojektowaliśmy komorę przepływową z równoległymi płytkami oraz obwód przepływu ciągłego, co pozwala nam badać komórki w warunkach przepływu i obserwować je przez przezroczystą komorę.

Technika ta może służyć jako wartościowe narzędzie badawcze w dziedzinie medycyny i inżynierii. Nasza komora przepływowa umożliwia okresową lub w czasie rzeczywistym wizualizację komórek w przepływie przy użyciu mikroskopu prostego lub odwróconego. Ponadto konstrukcja opracowana przez dr. Ach Nicka pozwala badaczom na obrazowanie komórek zarówno na powierzchniach przezroczystych, jak i radioprzepuszczalnych, z wykorzystaniem standardowych obiektywów mikroskopowych.

Ponadto może to służyć jako ważne narzędzie w badaniach farmakologicznych do analizy wpływu leków na komórki w warunkach przepływu. Wizualizacja całego układu jest kluczowa, ponieważ niektóre z etapów są trudne do opanowania na podstawie samego protokołu. Przedstawię instrukcje krok po kroku, jak przygotować komorę przepływową oraz obwód przepływowy powszechnie stosowany w laboratorium dr. Ock Nexta w celu złożenia obwodu przepływowego.

Zacznij od przymocowania 36-calowego odcinka sztywnego przewodu do jednego końca tłumika pulsacji, a następnie do drugiego końca. Przymocuj 18-calowy odcinek miękkiego przewodu. Na końcu 18-calowej sekcji miękkiego przewodu umieść adapter z męskim złączem typu lure o średnicy 1/8 cala.

Połącz męski konektor z adapterem żeńskim o średnicy 1/8 cala. Przyłącz konektor żeński do nowego, 18-calowego odcinka miękkiego wężyka. Wywierć trzy otwory w zakrętce zlewki szklanej o pojemności 250 ml.

Aby dopasować rurkę, należy włożyć 1,5 calowy odcinek miękkiej rurki do jednego otworu, który będzie służył jako odpowietrznik. Wolne końce twardej i miękkiej rurki należy przełożyć przez dwa pozostałe otwory w zakrętce do szklanej butelki o pojemności 250 mililitrów, która będzie pełnić funkcję zbiornika.

Upewnij się, że sztywna rurka sięga dna zbiornika. Utrzymanie sterylności podczas całego procesu przygotowania obwodu jest kluczowe dla powodzenia tej procedury. W związku z tym wszystkie elementy muszą zostać wysterylizowane, a podczas pracy należy stale używać sterylnych rękawiczek.

Oprócz zmontowanych części, należy wysterylizować następujące elementy: jedną kompletną komorę przepływową, odcinki miękkiego wężyka o wymiarach 3x2 cale, jeden adapter Luer male i jeden Luer female o średnicy 1/8 cala, cztery wkręty z łbem płaskim 1/2 cala, 6 5/16 cala, osiem wkrętów z łbem płaskim 30 tpi (nitków na cal), jedną pęsetę, jedno szkiełko przedmiotowe oraz dwa ręczniki, sterylizując je za pomocą pary.

Autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 60 minut. Umieść komorę przepływową obwodu przepływowego, dwa czworodrożne kurki odcinające, jeden jednodrożny kurek odcinający oraz wszystkie wysterylizowane części na tym sterylnym polu. W rękawicach sterylnych połącz dwa czworodrożne kurki odcinające.

Załóż nakrętki na otwarte porty próbkowania. Odłącz męskie i żeńskie adaptery łączące dwa segmenty elastycznego przewodu w obwodzie przepływowym i wstaw podłączone kurki odcinające. Połącz elastyczny przewód wprowadzony do zbiornika z strzykawką o pojemności 30 milliliter i wyjmij tłok strzykawki.

Napełnij butelkę 125 mililitrami pożywki EPC. Ponownie podłącz elastyczny przewód do kurka odcinającego. Włóż sterylny filtr strzykawkowy do otworu odpowietrzającego.

Następnie przenieś obwód przepływowy do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C, przy 5% dwutlenku węgla. Zamocuj sztywną rurkę w głowicy pompy perystaltycznej Master Flex przeznaczonej do pracy z tym typem rurek Palmer. Upewnij się, że rurka nie nakłada się na prowadnice montażowe pompy rolkowej.

Zaznacz markerem rurki w miejscach, w których opuszczają one głowicę pompy po obu stronach. Po upewnieniu się, że wszystkie kurki odcinające są zamknięte w stronę portów z próbkami i otwarte wzdłuż obwodu przepływu, uruchom pompę. Zweryfikuj kierunek przepływu.

Przez szklny zbiornik i sztywne rurki PERFUSE eight powinien przepływać do tłumika pulsacji. W celu złożenia komory przepływowej należy użyć sterylnych rękawiczek, aby połączyć jeden 2-calowy odcinek miękkiej rurki z żeńskim adapterem Luer 1/8 cala. Następnie należy połączyć kolejny 2-calowy odcinek miękkiej rurki z męskim adapterem Luer 1/8 cala.

Podłączyć dwucalowy miękki przewód z żeńskim adapterem typu lure do portu wlotowego, a dwucalowy miękki przewód z męskim adapterem typu lure do portu wylotowego. Do obu tych adapterów lure przymocować czterodrożne kurki odcinające. Pozostały dwucalowy fragment miękkiego przewodu połączyć z łącznikiem portu bocznego wychodzącego z pułapki pęcherzykowej i za pomocą sterylnej pęsety przymocować zawór jednokierunkowy.

Wyjmij preparat z nasiewem komórek z naczynia do hodowli i umieść go w zagłębieniu na spodniej płycie komory przepływowej. Upewnij się, że preparat jest umieszczony stroną z nasiewem komórek do góry; za pomocą strzykawki lub pipety nalej 10 mililitrów ciepłego pożywki EPC na preparat z komórkami. Pozwól, aby pożywka pokryła preparat w komorze przepływowej, dbając o to, aby medium nie przelało się nad uszczelką O-ring na spodniej płycie.

Umieść górną płytkę komory przepływowej na płytce dolnej, dopasowując otwory na śruby. Utrzymaj obie płytki równolegle, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do komory. Skręć płytki razem. Używając automatycznego akumulatorowego wkrętaka, odpowietrz pułapkę pęcherzyków na wlocie, otwierając zawór jednokierunkowy przymocowany do portu pułapki pęcherzyków po stronie wlotowej.

Użyj strzykawki 10 ml, aby delikatnie przepłukać przewód dopływowy medium EPC, a następnie zamknij ten kurek i załóż nasadkę. Teraz usuń powietrze z kanału komory, otwierając czterodrożny kurek portu odpływowego i delikatnie przepłukując komorę przepływową medium EPC. Ponownie, używając strzykawki 10 ml, załóż nasadki na wszystkie przyłącza czterodrożnego kurka i zamknij je.

Przenieś komorę przepływową wraz z zmontowanym układem przepływowym do inkubatora z nawilżaczem. Wstrzymaj pracę pompy układu przepływowego i zamknij kurki odcinające w układzie przepływowym zgodnie z kierunkiem przepływu, aby zapobiec wyciekom.

Podłącz komorę przepływową do obwodu przepływowego. Po podłączeniu komory przepływowej do obwodu przepływowego otwórz kurki w kierunku przepływu. Uruchom pompę przepływową i upewnij się, że PERFUSE eight płynie w prawidłowym kierunku. Dostosuj szybkość przepływu do pożądanego naprężenia ścinającego.

Podczas eksperymentu z przepływem komorę przepływową można usunąć z obiegu, aby obrazować komórki za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. W tym celu należy odłączyć komorę przepływową od obwodu przepływowego w miejscach połączeń kurek odrzutowych. Aby zebrać próbki perfuzyjne do analizy.

W pierwszej kolejności należy zatrzymać pompę i zamknąć kurek odcinający znajdujący się najbliżej tłumika pulsacji. Zdjąć z niego nasadkę ochronną, kładąc ją dnem do góry, aby zapobiec kontaminacji. Wprowadzić małą strzykawkę do portu poboru próbek.

Zamknij kurek w kierunku komory przepływowej, pozostawiając otwarcie port próbkowy i obwód w kierunku tłumika pulsacji. Pobierz pożąganą ilość próbki z obwodu, a następnie zamknij kurek w stronę portu próbkowego przed wyjęciem strzykawki. Przechowuj pobraną próbkę w opisanej probówce i zamroź w temperaturze -80 °C.

Zakręć port próbkowy i upewnij się, że wszystkie kurki są otwarte przed rozpoczęciem przepływu. Przy zastosowaniu tej metody ludzkie komórki progenitorowe śródbłonka pochodzące z krwi mogą zostać wysiane na płytki tytanowe w ciągu 15 minut i przywrzeć w warunkach fizjologicznych sił ścinania. Jak pokazano na tej figurze, EPC rozprzestrzeniają się pod wpływem przepływu od około 210 µm² bezpośrednio po wysianiu do około 657 µm² po trzech godzinach i około 1 152 µm² po 48 godzinach naprężenia ścinającego płynu wynoszącego 15 dyn/cm².

Ten obraz z mikroskopu świetlnego ilustruje losową orientację ludzkich EPC. Po sześciogodzinnym okresie statycznego osadzania, poprzedzającym trzy godziny przepływu z siłą 100 dines na centymetr kwadratowy, komórki rozprzestrzeniły się, lecz zachowały losową orientację. Po 48 godzinach działania naprężenia ścinającego cieczy o wartości 100 dines na centymetr kwadratowy, EPC są wyrównane i zorientowane zgodnie z kierunkiem przepływu.

W tym przypadku EPCs zostały oznakowane CTO, a jądra komórkowe barwiono herx po zakończeniu przepływu. Dla porównania, obraz ten przedstawia świńskie EPCs na płytkach tytanowych w orientacji zgodnej z kierunkiem przepływu. Po 48 godzinach przepływu i ekspozycji na naprężenie ścinające o wartości 15 dines na centymetr kwadratowy, brzegi komórek wybarwiono przeciwciałem przeciw pcam, a jądra barwiono barwnikiem kwasów nukleinowych cytoxin.

Metoda ta umożliwia również pobieranie próbek z PERFUSE eight w określonych punktach czasowych w celu analizy i/lub kwantyfikacji wydzielanych metabolitów komórkowych. Przedstawiono tutaj przykład produkcji azotynów podczas 48-godzinnego eksperymentu z przepływem z udziałem świńskich EPCs. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie sterylności przez cały czas.

Dodatkowo ważne jest podjęcie niezbędnych kroków w celu zredukowania liczby pęcherzyków powietrza w komorze przepływowej przed rozpoczęciem przepływu ciągłego, ponieważ mogą one oderwać komórki. Zalecamy również sprawdzenie każdego połączenia w komorze przepływowej i obwodzie przed perfuzją, aby zapobiec wyciekowi PERFUSE eight podczas eksperymentu. Komora ta została zaprojektowana z wbudowanymi o-ringami, które umożliwiają pełne przeciwstawienie się płytki górnej i dolnej oraz zapewniają szczelność bez konieczności stosowania pomp próżniowych.

Ta cecha zapewnia również stałą wysokość komory pomiędzy eksperymentami i eliminuje potrzebę stosowania uszczelek gumowych lub dokonywania regulacji. Nasza komora przepływowa wykorzystuje standaryzowane szkiełka przedmiotowe. Dzięki temu duża liczba komórek jest dostępna do dalszych doświadczeń.

Na przykład RNA i DNA z komórek po przepływie mogą być poddane ocenie pod kątem syntezy białek lub ekspresji genów. Konstrukcja naszego układu umożliwia pobranie ośmiu próbek z perfuzji do analizy i kwantyfikacji metabolitów komórkowych, takich jak azotyn, który jest głównym utlenionym metabolitem tlenku azotu wydzielanego przez komórki pod wpływem naprężenia ścinającego cieczy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat montażu naszej komory przepływowej oraz sterylnego układu przepływowego w celu poddania komórek adherentnych naprężeniu ścinającemu cieczy.