Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego DiI

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja kutykuli u przezroczystych, żywych osobników C. elegans przy użyciu czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego Dye Eye. Jest to realizowane poprzez przygotowanie populacji nicieni do barwienia. Następnie do populacji dodaje się rozcieńczony Dye Eye i poddaje inkubacji.

Następnie zwierzęta wyjmuje się z roztworu barwiącego. Obrazowanie fluorescencyjne kutikuli zabarwionej barwnikiem Dai ukazuje szczegóły powierzchni, w tym struktury rozrodcze Ailey i Ann eye oraz inne zewnętrzne cechy morfologiczne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wizualizacji kutikuli u tego przezroczystego organizmu, takimi jak bezpośrednie obrazowanie, fluorescencja, ekspresja transgenów, barwienie przeciwciałami, mikroskopia elektronowa i znakowana aglutynina z zarodków pszenicy, jest to, że metoda ta jest łatwa do przeprowadzenia, stosunkowo szybka i niedroga, a także zapewnia wysoką rozdzielczość struktur kutikularnych u żywych zwierząt.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w wielu dziedzinach wykorzystujących model systemowy C. elegans oraz jego kutykulę, takich jak sekrecja komórkowa i organizacja kutykuli, rozwój komórek naskórka, heterochroniczne szlaki genowe, odporność wrodzona, rozwój cech morfologicznych oraz ewolucja nicieni. Procedurę zademonstruje Robbie Schultz, doktorant z mojego laboratorium. Podczas pracy z barwnikiem DiI należy pamiętać, że jest on światłoczuły.

Zawsze należy chronić D eye przed światłem, owijając je folią. Należy również stosować rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ DMF jest toksyczny, a DAI jest rakotwórczy. Cyjanek Dai jest bardzo silny.

Standardowe stężenie roztworu roboczego to 30 µg/mL DII w M9; pojedyncza populacja wymaga zaledwie 400 µL roztworu roboczego. Należy rozpocząć od płytki 60 mm z populacją niekontaminowanych nicieni. Zwierzęta z płytki należy wypłukać w 1,5 mL 0,5% Triton X 100.

W buforze M nine delikatnie zamieszaj ciecz kolistymi ruchami, aby odseparować wszystkie larwy i osobniki dorosłe, a następnie przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml. Natychmiast odwiruj zwierzęta z prędkością 2000 RRP M przez 30 sekund, aby zebrać je na dnie probówki. Odlej jak najwięcej nadsączu, uważając, aby nie poruszyć osadu ze zwierzętami.

Należy zachować ostrożność i unikać pobierania zbyt dużej ilości materiału. Przemyć zwierzęta 1 mL buforu M9. Odwiruj i usuń nadsącz.

Powtórz płukanie. Ponownie odwiruj próbkę i usuń nadsącz. Następnie do probówki dodaj 400 µL roztworu Dai o stężeniu 30 µg/mL w buforze M9.

Krótko wymieszaj probówkę w vortexie, aby resuspender zwierzęta. Następnie inkubuj probówkę w pozycji poziomej w temperaturze 20 °C przez okres od 3 do 16 godzin przy 350 RPM w warunkach chronionych przed światłem. Czas trwania tych ostatnich kroków jest istotny.

Po pierwsze, należy wypłukać Triton X, zanim usunie on lipidy, z którymi wiąże się barwnik. Po drugie, zwierzęta muszą być barwione w roztworze barwnika wystarczająco długo, aby kutykula została zabarwiona jednorodnie. Następnie zwierzętom należy pozwolić na regenerację na pożywce przez czas wystarczający do usunięcia niezwiązanego barwnika.

Po zakończeniu barwienia odwirować zwierzęta i usunąć roztwór barwnika. Przemyć zwierzęta jednym mililitrem M9. Aby usunąć niezwiązany barwnik, odwirować zwierzęta i usunąć nadsącz.

Ponownie zawiesić zwierzęta w 400 µL buforu M9 i przelać je na wolną od bakterii część mikroplatek NGM. Po zaszczepieniu bakteriami E. coli szczep OP50 pozostawić zwierzęta do regeneracji w ciemności przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż przez jeden dzień, ponieważ fluorescencja barwnika zanika w czasie regeneracji. Zwierzęta powinny odpełznąć z cieczy barwiącej na pożywkę.

Zwierzęta te są łatwiejsze do obrazowania, ponieważ wykazują mniejszą fluorescencję tła pochodzącą z wolnego barwnika w oku. Należy rozpocząć od przygotowania podkładki agarowej na szkiełku przedmiotowym, stosując dwa dystanse w celu zapewnienia jednolitej grubości użytej podkładki agarowej.

Dystans tworzy się poprzez nałożenie dwóch warstw taśmy laboratoryjnej na szkiełko przedmiotowe. Dystansy można wykorzystywać wielokrotnie. Następnie należy umieścić czyste szkiełko przedmiotowe wzdłuż między dwoma szkiełkami z dystansami i nanieść pipetą około 150 µL roztopionego agaru 4.

Na środek czystego szkiełka przedmiotowego. Szybko przykryć stopione AER dodatkowym szkiełkiem umieszczonym prostopadle nad AER oraz obydwoma dystansami, aby utworzyć podkładkę agarową. Ostrożnie zsunąć szkiełko przykrywowe, utrzymując podkładkę wycentrowaną na górnej powierzchni szkiełka montażowego.

Teraz nanieś pipetą 5 µL anestetyka dla nicieni na podkładkę, umieść od 8 do 12 zwierząt w anestetyku i delikatnie przykryj szkiełkiem podstawowym. Obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopu złożonego lub konfokalnego wyposażonego w obiektyw o powiększeniu co najmniej 40 x oraz filtr TRITC lub inny kompatybilny filtr. Maksimum wzbudzenia fluorescencyjnego barwnika Dye I wynosi 549 nm, a maksimum emisji 565 nm.

W przypadku obrazowania związanych zgonów ta część protokołu jest najtrudniejsza. Pokazujemy, jak montować zwierzęta do obrazowania, jednak wymagane jest odpowiednie przeszkolenie w obsłudze mikroskopu konfokalnego lub złożonego, którego będziesz używać. Stwierdzono, że zastosowanie obiektywu o powiększeniu co najmniej 60 x jest optymalne dla rozdzielczości szczegółów uwidocznionych za pomocą zastosowanej metody barwienia.

Każde z obrazów w tej sekcji zostało wykonane przy użyciu obiektywu 63 x w okresie pozazarodkowym C. elegans. Powierzchnia kutykuli jest podzielona pierścieniowo przez bruzdy okrężne, a w niektórych stadiach występują żebra podłużne nazywane ailey. Każde z obrazów w tej sekcji zostało wykonane przy użyciu obiektywu 63 x w okresie pozazarodkowym C. elegans.

Powierzchnia kutykuli zawiera pierścienie oddzielone bruzdami okrężnymi, a w niektórych stadiach grzbietami podłużnymi zwanymi aley. Każde stadium rozwojowe posiada struktury kutykularne o odmiennym składzie i wzorach, w tym grzbiety lub bruzdy zarówno aley, jak i Aly, które barwi się fluorescencyjnie w zależności od składu powierzchni.

W każdej z faz larwalnych oraz w stadium dorosłym, przy zastosowaniu tej metody barwienia, pozostają one widoczne do jednego dnia po odzyskaniu. Czasami obserwuje się fluorescencyjne plamki w tle, jednak nie dzieje się to rutynowo. Jest to kutykula dorosłych osobników mutantów wykazująca umiarkowane defekty organizacji kutykuli.

Grzebienie ailey są nieciągłe i nadliczbowe. Grzebienie ailey są zlane i rozgałęzione lub dwudzielne, co stanowi powszechny marker transgeniczny. Dominujący allel roll six powoduje skręcanie kutykuli, co można zaobserwować w obrębie ailey i co może prowadzić do nieregularnego rozmieszczenia pierścieni.

Barwnik Dai barwi również inne zewnętrzne struktury kutykuli, w tym dorosłego hermafrodytę, wulwę oraz wyniesienie i wachlarz ogona dorosłego samca; Dai może również uwydatnić subtelne defekty morfologii zewnętrznej, takie jak ten rozwidlony ogon, przy niewystarczającym barwieniu. Na przykład dwugodzinne barwienie prowadzi do niejednolitego zabarwienia kutykuli, choć neurony wystawione na działanie środowiska mogą zostać zabarwione. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, cały proces może zająć cztery godziny, nie licząc obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak barwić C. elegans barwnikiem Dai w celu obserwacji kutykuli i innych zewnętrznych struktur morfologicznych.