Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza polimerycznych nanocząstek przy użyciu metody nanoprecypitacji. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności reakcji E-D-C-N-H-S w celu otrzymania kopolimeru A-P-L-G-A PEG. Następnie kopolimer PLGA PEG jest wykorzystywany do wytworzenia nanocząstek, w których za pomocą nanoprecypitacji zostaje zamknięty odpowiedni lek lub ładunek.

Na tym etapie można przeprowadzić podstawową charakterystykę biofizyczną, obejmującą rozmiar, ładunek powierzchniowy oraz wydajność ładowania leku, wykorzystując dynamiczne rozpraszanie światła, transmisyjną mikroskopię elektronową lub HPLC. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię nowotworów, ponieważ nanocząsteczki mogą dostarczać słabo rozpuszczalne leki przeciwnowotworowe, co może okazać się bardziej skuteczne niż obecne metody leczenia. Metoda ta może zatem dostarczyć cennych informacji w zakresie leczenia raka.

Może być również wykorzystywany do badania innych układów, takich jak transport wewnątrzkomórkowy. Nanocząstki mogą zostać sprzężone z ligandem celującym i zwizualizowane in vivo lub in vitro przy użyciu czynnika obrazującego, co demonstruje tę technikę. Dzisiaj w badaniu wezmą udział dwaj technicy z naszego laboratorium, Rohit Sukumar i Natalie Cummings. Aby rozpocząć syntezę kopolimeru PLGA PEG, należy rozpuścić karboksylowany PLGA w acetonitrylu w stężeniu 5 mM przy łagodnym mieszaniu.

Następnie dodaj odpowiednią ilość NHS i EDC, aby uzyskać stężenia 25 millimolar, zapewniając pięciokrotną nadwyżkę stechiometryczną w stosunku do PLGA; delikatnie mieszaj roztwór przez około jedną godzinę, aby umożliwić konwersję grupy karboksylowej PLGA do PGA NHS. Po godzinie wytrąc produkt reakcji PGA NHS, dodając roztwór płuczący – metanol w objętości około 10 razy większej niż objętość roztworu; odwiruj roztwór przy 2000 ×g, aby uzyskać osad P-L-G-A-N-H-S. Po wirowaniu odlej nadsącz, aby usunąć ślady EDC i NHS. Tę procedurę płukania metanolem powtórz co najmniej trzy razy.

Po zakończeniu płukania wysuszyć P-L-G-A-N-H-S w próżni przez 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady roztworu płuczącego. Następnie ponownie rozpuścić pellet P-L-G-A-N-H-S w aceto NI trial w tym samym stężeniu, którego początkowo użyto do rozpuszczenia PLGA.

Po rozpuszczeniu dodać heterobifunkcyjny PEG do roztworu PLGA. Zastosować stężenie 5 mM.

Inkubować roztwór mieszaniny przez 24 godziny przy stałym mieszaniu. Wytrącić produkt reakcji blokowego kopolimeru PLGA PEG poprzez dodanie nadmiaru metanolu. Przeprowadzić proces płukania i wirowania dodatkowo trzy razy, aby usunąć cały nadmiar nieprzereagowanego peg.

W ostatnim etapie syntezy należy wysuszyć kopolimer blokowy PLGA PEG pod próżnią. Wytrącanie nanocząstek rozpoczyna się od rozpuszczenia kopolimeru blokowego PLGA PEG oraz leku przeznaczonego do enkapsulacji w rozpuszczalniku A-P-L-G-A. Wybór rozpuszczalnika jest krytyczny, ponieważ wpływa on na właściwości nanocząstki. Następnie mieszaninę polimeru z lekiem dodaje się kroplami do trzech do 10 objętości mieszanej wody, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru na poziomie około 3 mg/mL. Kroplami.

Dodanie roztworu organicznego do fazy wodnej ma kluczowe znaczenie dla uformowania nanocząsteczek o odpowiednim rozmiarze. Kontynuuj mieszanie przez dwie godziny pod zmniejszonym ciśnieniem, aby umożliwić formowanie nanocząsteczek poprzez samozgromadzenie i usunąć ślady rozpuszczalnika organicznego. Po dwóch godzinach mieszania.

Skoncentrować nanocząstki poprzez wirowanie przy 2 700 ×g przez 10 minut, używając filtra Amon. Następnie przemyć nanocząstki buforem PBS, aby usunąć lek, który nie został zamknięty w cząstkach, a następnie ponownie poddać je wirowaniu. Na koniec resuspendować nanocząstki w buforze PBS.

W celu lepszego zrozumienia właściwości nanocząsteczek można przeprowadzić podstawową charakterystykę biofizyczną, obejmującą pomiar wielkości, ładunku powierzchniowego oraz wydajności załadunku leku. Nanocząsteczki można przechowywać zgodnie z opisem w protokole pisemnym; aby scharakteryzować nanocząsteczki PLGA PEG, w celu potwierdzenia ich wielkości, rozkładu i struktury zastosowano transmisyjną mikroskopię elektronową. Wielkość cząstek mieści się zazwyczaj w zakresie nanometrów.

Duże rozmiary cząstek przy nierównomiernym rozkładzie wielkości mogą wskazywać albo na błąd w reakcji koniugacji, albo na konieczność optymalizacji metody nanoprecypitacji. Przedstawiono tutaj badanie kinetyki uwalniania leku, w którym wydajność załadunku oraz uwalnianie paklitakselu ilościowo określono za pomocą standardowej metody HPLC. Znane, stałe ilości nanocząsteczek poddawano dializie w stałych odstępach czasu.

Zawartość jednostki dializacyjnej została zebrana, a następnie dodano równą objętość rozpuszczalnika organicznego w celu rozpuszczenia nanocząsteczek. Następnie w tych próbkach przeprowadzono analizę HPLC. Aby określić zawartość Paclitaxelu, po opanowaniu tej techniki nanowytrącania, można ją prawidłowo przeprowadzić w ciągu trzech godzin.

Pamiętaj, aby podczas wykonywania tej techniki zawsze powoli dodawać fazę organiczną do fazy wodnej, co zapobiegnie powstawaniu dużych cząstek po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę badaczom nowotworów w dziedzinie nanomedycyny do zbadania możliwości zastosowania leków słabo rozpuszczalnych, które wcześniej uznawano za zbyt toksyczne dla pacjentów onkologicznych po zastosowaniu tej procedury. W celu odpowiedzi na pytania, takie jak to, czy leki słabo rozpuszczalne są skuteczne, gdy toksyczność systemowa nie stanowi już problemu, lub czy ligandy kierujące właściwie dostarczają nanocząsteczki do miejsca docelowego, można przeprowadzić inne metody, takie jak badania skuteczności in vivo lub badania obrazowe.