Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Niniejsza procedura umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym śmierci komórek glejowych w wyniku oligo DDR. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę komórek, a następnie przygotowanie ich do obrazowania komórek żywych. Kolejnym krokiem jest poddanie komórek działaniu czynnika terapeutycznego i monitorowanie efektów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie analizy danych. Ostatecznie wyniki wskazują na tempo śmierci komórek w populacji komórkowej po zastosowaniu leczenia lub bodźca, poprzez monitorowanie fluorescencji jąder komórkowych za pomocą barwnika fluorescencyjnego aktywowanego przez kaspazy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie immunocytochemiczne, jest możliwość jednoczesnego gromadzenia danych z wielu punktów czasowych.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak reakcje na farmakologiczne, reagentowe i różnorodne zabiegi. Obecnie metoda ta może dostarczyć informacji o procesach obumierania w kulturach komórkowych. Można ją również zastosować w innych systemach, takich jak tkanki ex vivo i organotypowe, w tym w przypadku skrawków mózgu.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności podczas adaptacji do pracy z tkanką żywą zamiast tkanki utrwalonej. Demonstracja wizualna tej techniki jest istotna, ponieważ przygotowanie próbek żywych komórek wiąże się z większą liczbą etapów w porównaniu do tkanki utrwalonej. Najpierw rozmrozić zamrożone unieśmiertelnione komórki glejowe N 19 oligo droog w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, oczekując na rozmrożenie komórek.

Do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm dodać siedem mililitrów pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny. Następnie dodać zawiesinę komórkową do naczynia kroplami i delikatnie potrząsnąć szalką Petriego, aby równomiernie rozproszyć komórki. Hodować komórki w temperaturze 34 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez cztery godziny.

Odssać pożywkę z płytek, aby usunąć pozostałości DMSO i krioprotektanta. Po czterech do siedmiu dniach wzrostu zastąpić ją siedmioma mililitrami świeżej pożywki. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, odessać pożywkę i nanieść pipetą jeden mililitr kropli na płat komórkowy, inkubując w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie zebrać komórki i zasiać je w 10 cm naczyniu hodowlanym w gęstości 0,1 × 10⁶ komórek/ml, a następnie umieścić naczynie w inkubatorze do hodowli tkanek. Po kolejnym pasażu komórki można wysiać do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek. W tym celu zebrać komórki w ten sam sposób co wcześniej, następnie pobrać 30 µl zawiesiny komórkowej i policzyć komórki za pomocą komory licznikowej Hemocytometru.

Następnie za pomocą sterylnej pęsety umieść niepowlekane szkiełka nakrywkowe. Do otworów płytki 6-dołkowej dodaj komórki w zagęszczeniu 0,1 × 10⁶ komórek/ml. W 2 ml medium DMEM z wysoką zawartością glukozy, wolnego od fenolu, uzupełnionego o 10% FBS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, pozwól komórkom rosnąć przez noc w temperaturze 34 °C i przy 5% CO2 przed przeprowadzeniem transfekcji.

Następnego dnia połączyć 100 µL medium bezsurowiczego, od 0,5 do 4 µg oczyszczonego plazmidowego DNA oraz 4 µL FUgene HD. Mieszaninę delikatnie wymieszać wirówką dwukrotnie, a następnie pozostawić DNA w temperaturze pokojowej przez pięć minut w celu utworzenia kompleksów. Po upływie czasu inkubacji dodać mieszaninę FUgene HD i DNA bezpośrednio do hodowlanych komórek.

Delikatnie przechyl płytkę, aby wymieszać zawartość. Następnie inkubuj komórki przez kolejne 48 godzin w temperaturze 34 °C i 5% carbon dioxide przed rozpoczęciem zabiegu lub eksperymentu. Najpierw włącz skrzynkę sterującą instrumentem do obrazowania żywych komórek LCI Cham light.

Należy to zrobić na trzy godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić dokładne rozgrzanie stolika. W minimalnym przypadku moduł sterujący powinien zostać włączony na jedną godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Następnie, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy spryskać komorę hodowlaną typu magnetycznego LCI Cham light oraz pęsetę 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na pięć minut.

Wyjmij komórki z inkubatora i obejrzyj je pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są zdrowe. Komórki powinny być wyraźne i dobrze rozprzestrzenione na szkiełku nakrywce, z licznymi wypustkami błonowymi. Komórki o zredukowanej liczbie wypustek lub o nieregularnym kształcie jądra są prawdopodobnie poddane stresowi wskutek transfekcji i nie nadają się do dalszych eksperymentów wykonywanych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Przechyl płytkę sześciodołkową i usuń szkiełko nakrywkę za pomocą pęsety. Szybko umieść szkiełko nakrywkę stroną z komórkami do góry w dolnej płytce komory. Nie dopuść do wyschnięcia szkiełka nakrywki.

Następnie przymocuj magnetyczną główną część komory hodowlanej i nanieś 500 µL medium z oryginalnej płytki 6-dołkowej na górną powierzchnię szkiełka podstawowego. Ponowne wykorzystanie medium zmniejsza stres komórkowy wywołany zmianami środowiskowymi i może być również przydatne przy ocenie czynników wydzielanych do środowiska pozakomórkowego. Po dodaniu medium nałóż szklaną pokrywę na komorę hodowlaną i za pomocą chusteczki Kimwipe nasączonej 70% etanolem usuń z dolnej strony szkiełka podstawowego wszelkie pozostałości, które mogłyby zakłócić obraz podczas mikroskopii.

Umieść komorę hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 34 °C i 5% carbon dioxide na 30 minut. Krok ten zapewni rozgrzanie samej komory do 34 °C, aby zminimalizować przesuwanie się szkiełka nakrywkowego. W miarę nagrzewania się metalu, w kolejnych krokach należy pracować przy jak najniższym oświetleniu pomieszczenia.

Najpierw Thora wcześniej przygotowała kulturę nuke view w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij komorę hodowlaną z inkubatora i szybko umieść ją w komorze środowiskowej mikroskopu. Włącz butlę z 5% gotową mieszaniną dwutlenku węgla z podwójnym regulatorem.

Następnie, używając obiektywu 10x przy napięciu lampy mikroskopu ustawionym na około 2,5 V i czasie ekspozycji wynoszącym 240 ms, ustaw ostrość w trybie mikroskopii w polu jasnym, aby zwizualizować komórki na monitorze komputera. Następnie dodaj do komórek jony potasu w stężeniu 80 mM lub inny induktor apoptozy poprzez wymianę medium z zastosowaniem powolnej perfuzji lokalnej za pomocą pompy perystaltycznej.

Podłoże nuke view 4 88 jest stabilne w hodowli komórkowej w eksperymentach trwających do 36 godzin. W związku z tym możliwe jest przeprowadzanie doświadczeń w tym przedziale czasowym. Najpierw należy ustawić mikroskop tak, aby umożliwić wizualizację fluorescencji czerwonego i zielonego białka fluorescencyjnego.

Następnie kliknij kanał czerwony, aby wyświetlić przetransfekowane komórki. Wybierz i zapisz około 12 klatek, na których widocznych jest kilka przetransfekowanych komórek, a następnie zapisz te punkty stolika XY. Ustaw mikroskop tak, aby co sześć minut rejestrował obrazy w jasnym polu w kanale czerwonym oraz kanale zielonym w tych zapisanych punktach stolika.

Po zebraniu wielu punktów XY z eksperymentów przeprowadzonych w dubletach lub triplikatach, zestaw dane z oddzielnych doświadczeń wykonanych w różne dni i przeprowadź analizę danych oraz testy statystyczne zgodnie z opisem w protokole pisemnym, aby porównać stosunek komórek z ujemnym sygnałem w zatoce CASP do komórek z dodatnim sygnałem w zatoce CASP. Podłoże Nuke view 4 88 może wskazywać na zwiększone tempo apoptozy w kulturach komórek glejowych N 19 oligo DDR. Obrazy bazowe zostały uzyskane przy użyciu obiektywu 10x po zastosowaniu wysokiego stężenia potasu zewnątrzkomórkowego.

Komórki N 19 przetransfekowano białkiem RFP, a następnie poddano działaniu trzech mikrolitrów substratu NukeView 488 (w przypadku komórek kontrolnych) lub trzech mikrolitrów substratu NukeView 488 oraz 80 milimolowego roztworu potasu. Obrazy te pokazują, że liczba komórek apoptotycznych zwiększa się w czasie – odpowiednio trzy, sześć i dziewięć godzin po traktowaniu 80 milimolowym roztworem potasu. W warunkach kontrolnych nie zaobserwowano istotnych ilości apoptozy w porównaniu z kulturami traktowanymi 80 milimolowym roztworem potasu. Tło w postaci zielonego sygnału zaobserwowane w warunkach kontrolnych wskazuje na komórki przechodzące apoptozę bez dodania potasu zewnątrzkomórkowego.

12-godzinny przebieg czasowy jest wystarczający dla badań obejmujących uszkodzenia neurologiczne. Po 12 godzinach w kulturach traktowanych potasem odnotowano około 45% śmierci komórek. Praktycznie żadna z komórek w eksperymencie kontrolnym nie wykazuje apoptozy w 12. godzinie. Choć w innych sytuacjach eksperymenty mogą wymagać dłuższego czasu trwania.

Ten wykres przedstawia wzrost liczby komórek wykazujących pozytywną reakcję na kaspazę 3 w czasie trwania 12-godzinnego eksperymentu. Po opanowaniu metody, technikę tę można przeprowadzić w ciągu jednej godziny, a dane można zebrać przez noc, jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest zachowanie spójności między poszczególnymi wariantami traktowania zgodnie z opisany metodą.

Do badania innych białek efektorowych zaangażowanych w analizowane szlaki sygnałowe można wykorzystać inne metody, takie jak barwienie immunocytochemiczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat przygotowania próbek do obrazowania. Należy teraz zebrać zestaw danych i przeprowadzić jego analizę.