Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy
14 listopada 2025
Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania przepuszczalności błony lizosomalnej podczas nekroptozy, wykorzystującą sondy fluorescencyjne wykrywające zmiany w integralności błony lizosomalnej i zakwaszeniu.
Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania permeabolizacji błony lizosomalnej podczas nekrotozy, wykorzystując sondy fluorescencyjne, które wykrywają zmiany integralności błony lizosomalnej oraz zakwaszenie. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest scharakteryzowanie dynamiki uszkodzenia organelli podczas procesu śmierci komórkowej oraz precyzyjne określenie, jak to uszkodzenie powinno powodować lub przyczyniać się do śmierci komórek. Na początek należy umieścić 5 000 komórek w dwóch mililitrach podłoża DMEM z antybiotykami do sterylnej misy o szklanym dnie.
Umieść naczynie w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i inkubuj komórki przez noc. Dodaj 20 mikrolitrów zielonych kulek dextran do 25 mikrogramów na mililitr w świeżym, antybiotykowym medium DMEM, aby je rozcieńczyć. Usuń stare medium z naczynia i zastąp je dwoma mililitrami medium zawierającego wołowinę z dodatkiem DMEM.
Włóż naczynie do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i inkubuj przez 24 godziny, aby umożliwić internalizację koralików w lizosomach. Następnie dodaj dwa mikrolitry jednego milimolowego roztworu LysoTracker do dwóch mililitrów świeżego medium DMEM. Wymień stare medium na ten roztwór do bejczenia.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny. Włącz komponenty systemu konfokalnego, włączając komputer osobisty, mikroskop, zasilanie skanera, zasilanie lasera, emisję laserową oraz zasilanie Leica. Włącz sterowanie środowiskowe, w tym regulator temperatury, zwany Cube, oraz kontroler mieszanki dwutlenku węgla, zwany Brick.
Otwórz dopływ dwutlenku węgla i tlenu. Ustaw regulator temperatury na 37 stopni Celsjusza. Ustaw regulator gazu i wilgotności na 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności.
Złóż komorę obrazowania. Po barwieniu umyj komórki trzy razy dwoma mililitrami PBS, a następnie dodaj dwa mililitry świeżo uzupełnionego medium DMEM. Nałóż olejek immersyjny na obiektyw przed zdjęciem.
Zamontuj antenę na scenie mikroskopu. Reguluj intensywność lasera do 3%, ale nie więcej niż 5%. Następnie dostosuj wzmocnienie detektora w oprogramowaniu mikroskopu, aby zoptymalizować sygnał. Zminimalizuj tło, regulując pasek kontrastu.
Zrób zdjęcia bazowe nieleczonych komórek, które stanowią warunek kontrolny. Wróć płytkę do maski laminarnej i dodaj jeden mililitr antybiotyku DMEM, uzupełniony induktorami śmierci komórek. W oprogramowaniu do akwizycji ustaw tryb na XYT, format na 512 na 512, prędkość na 400, zoom na trzy, średnią linii na jeden, gromadzenie linii na trzy, gromadzenie klatek na jeden, interwał czasu na trzy minuty, czas trwania na osiem godzin oraz włącz autofokus.
Kliknij start, aby rozpocząć akwizycję w czasie poklatkowym. Wstępne badania obrazowe potwierdziły obecność stabilnych punktów LysoTracker oraz fluoresceinowego znakowanego dekstranu, wskazując na nienaruszone lizosomy przed leczeniem. Cztery godziny po leczeniu TSZ fluorescencja LyoTracker była wyraźnie zmniejszona, podczas gdy dekstran zaczął wykazywać rozproszony rozkład cytosolowy, co wskazuje na początkową permeabilizację błony lizosomalnej.
Osiem godzin po leczeniu sygnał LysoTracker niemal całkowicie zniknął, podczas gdy wiele komórek zachowało zielony dekstern puncta z rozproszonym zielonym sygnałem cytosolowym. Wykazujemy, że permeabolizację błony lizosomalnej można bezpośrednio zobrazować w żywej komórce poddawającej indukcji nekrototycznej. Protokół ten pokazuje, że połączenie LysoTracker i kulek dektranowych umożliwia jednoczesne monitorowanie pH lizosomu i uwalniania ładunku w czasie rzeczywistym.
Ważnym dla rozwoju tego protokołu obrazowania komórek żywych jest jego zdolność do monitorowania niewielkich zmian pH i przepuszczalności błony lizosomalnej w czasie rzeczywistym, rejestrując dynamiczne zdarzenia, które są pomijane przez analizę końcową, taką jak cytometria przepływowa i barwienie monowarstwowe.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek do monitorowania permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy. Metoda ta wykorzystuje sondy fluorescencyjne do wykrywania zmian w integralności błony lizosomalnej oraz zakwaszeniu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Obrazowanie żywych komórek
Wstęp
- Charakterystyka uszkodzeń organelli podczas śmierci komórki jest kluczowa.
- Zrozumienie, w jaki sposób uszkodzenia lizosomów przyczyniają się do obumarcia komórek, stanowi wyzwanie.
- Obrazowanie żywych komórek umożliwia obserwację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Sondy fluorescencyjne mogą wskazywać na integralność lizosomów oraz zmiany pH.
Cel badania
- Opracowanie metody monitorowania permeabilizacji błony lizosomalnej.
- Wizualizacja zmian w czasie rzeczywistym podczas nekroptozy.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki lizosomów w procesie śmierci komórki.
Zastosowane metody
- Wysiew komórek i inkubacja w pożywce DMEM z dodatkiem antybiotyków.
- Barwienie LysoTrackerem oraz koralikami dekstranowymi w celu wizualizacji lizosomów.
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania zmian komórkowych w czasie.
- Akwizycja time-lapse w celu monitorowania integralności i pH lizosomów.
Główne wyniki
- Obrazowanie wstępne wykazało stabilność lizosomów przed indukcją nekroptozy.
- Po zastosowaniu preparatu zaobserwowano permeabilizację błony lizosomalnej.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym ujawniło zmiany pH lizosomów oraz uwalnianie zawartości.
- Metoda ta pozwala na uchwycenie dynamicznych zdarzeń komórkowych, które są pomijane w analizach końcowych.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na skuteczną wizualizację zmian błony lizosomalnej podczas nekroptozy.
- Połączenie LysoTracker i kulek dekstranowych dostarcza kompleksowych informacji.
- Podejście to przyczynia się do rozwoju badań nad mechanizmami śmierci komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Obrazowanie komórek żywych w czasie rzeczywistym w celu obserwacji permeabilizacji błony lizosomalnej (LMP) podczas nekroptozy pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu mechanizmów regulowanej śmierci komórkowej, co jest kluczowe dla walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Podejście to umożliwia precyzyjne mapowanie czasowe dysfunkcji organelli, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach wczesnego etapu odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych. Integracja dynamicznego monitorowania LMP wspiera decyzje dotyczące portfela projektów poprzez wyjaśnienie szlaków śmierci komórkowej i potencjalnych punktów interwencji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację dysfunkcji lizosomalnej jako wczesnego zdarzenia nekroptozy.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie LMP z późniejszymi skutkami śmierci komórkowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i badania szlaków sygnałowych.
- Ułatwia selekcję celów na podstawie funkcjonalnych odczytów w czasie rzeczywistym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane układy żywych komórek do ilościowej oceny integralności lizosomów.
- Umożliwia powtarzalne i skalowalne testy obrazowania do przesiewania związków.
- Dostarcza zestandaryzowane, multipleksowe odczyty zmian pH oraz uwalniania ładunku.
- Wspiera rzetelną ewaluację potencjalnych modulatorów wpływających na szlaki nekroptozy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje mechanistyczne markery śmierci komórkowej z modelami istotnymi dla danej choroby, jeśli jest to możliwe.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedkliniczną walidację mechanizmów śmierci komórkowej.
- Wspiera zaawansowanie prac z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez wyjaśnienie okien interwencyjnych i dynamiki biomarkerów.
- Zapewnia predykcyjną redukcję ryzyka w strategiach translacyjnych dotyczących biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania żywych komórek wpisuje się w kontinuum od fazy odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając dynamiczną ocenę integralności organelli oraz postępu śmierci komórkowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących sekwencji i przyczynowości zdarzeń nekroptozy.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników obrazowania do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary pH lizosomów i uwalniania ładunku w czasie rzeczywistym do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wglądy mechanistyczne z walidacją modeli przedklinicznych po ustaleniu związku z chorobą.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę obrazowania wielokrotnego użytku dla zróżnicowanych badań nad śmiercią komórek i integralnością organelli.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad śmiercią komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy obrazowania żywych komórek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dynamiczne dane funkcjonalne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek oraz obsłudze mikroskopii konfokalnej.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury obrazującej oraz systemów kontroli środowiskowej.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów obrazowania i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych typów komórek lub modeli chorobowych.
- Ograniczone koniecznością posiadania infrastruktury do obrazowania w czasie rzeczywistym oraz kompatybilnością sond fluorescencyjnych.
