Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Witajcie, jestem Jersey. Cześć, nazywam się Shabi. Oboje jesteśmy pracownikami naukowymi na stopniu postdoctoral w Imperial College London, gdzie współpracujemy z profesorem Andrew Di Melo i dr. Joshem Delem w zakresie mikrofluidycznych platform kropelkowych. Mikrofluidyczne platformy oparte na kropelkach są obiecującymi narzędziami do eksperymentów o wysokiej przepustowości, ponieważ kropelki mogą być generowane w bardzo wysokich, precyzyjnie określonych objętościach, a częstotliwość ich powstawania może osiągać kilka kiloherców.

Ponadto, ponieważ obszar zainteresowania może zostać zamknięty w przedziałach o objętości zaledwie kilku litrów, można wyeliminować zarówno interferencje (crosstalk), jak i dyspersję, a procesy analityczne mogą być czasowane z większą dokładnością. W naszej grupie z sukcesem wdrożyliśmy już platformy mikro kroplowe w wielu zastosowaniach. Na przykład w reakcji łańcuchowej polimerazy, syntezie nanocząsteczek oraz w analizach pojedynczych cząsteczek w komórce.

Duże ilości informacji generowanych w obrębie tych systemów muszą być efektywnie wyodrębniane, pozyskiwane i wykorzystywane. W związku z tym wybrana metoda detekcji powinna być odpowiednia, zapewniać wysoką czułość i niskie granice wykrywalności, być stosowalna dla szerokiego zakresu gatunków molekularnych, nieniszcząca oraz umożliwiać łatwą integrację z urządzeniami mikroprzepływowymi. Aby sprostać tym potrzebom, opracowaliśmy zestaw narzędzi i protokołów eksperymentalnych, które umożliwiają wyodrębnianie dużych ilości informacji fizycznych z środowisk o małej objętości i znajdują zastosowanie w analizie szerokiego zakresu obiektów fizycznych, chemicznych i biologicznych.

W niniejszym protokole przedstawimy dwie metody stosowane do detekcji pojedynczych komórek oraz mapowania procesów mieszania w kroplach. Chip mikrofluidyczne są tradycyjnie wytwarzane z poli(dimetylosiloksanu) PDMS przy użyciu metod fotolitografii. Proces ten powinien być przeprowadzany w pomieszczeniu typu clean room w celu uzyskania kanałów mikrofluidycznych: nanosi się SU-8 50 na wafer krzemowy metodą spin-coatingu, a następnie przeprowadza soft bake na płycie grzewczej w 65 °C i 95 °C, aby odparować rozpuszczalnik i zagęścić film; po ochłodzeniu naświetla się rezyst SU-8 promieniowaniem UV przez odpowiednią maskę, a następnie wypala wafer w 65 °C i 95 °C po uprzednim schłodzeniu.

Wywołaj nienaświetlone obszary, używając odpowiedniego roztworu wywołującego podczas mieszania. Użyj świeżego rozpuszczalnika EC do opłukania wafla, a następnie wysusz go strumieniem gazu, aby uzyskać czystą powierzchnię. Płucz wafelek heksanem i metanolem.

Aby zakończyć proces wytwarzania matrycy głównej, należy napać agent wiążący na powierzchnię w eksykatorze przez 40 minut. W celu utworzenia ustrukturyzowanych podłoży mikrofluidycznych, mieszamy S guard 1 8 4 w stosunku 10:1 żywicy do sieciującego i nakładamy tę mieszaninę na matrycę główną. Następnie odgazowujemy próbkę w eksykatorze i utwardzamy urządzenie w temperaturze 65 °C.

Wytnij utwardzony PDMS i oddziel go od matrycy. Za pomocą wycinaka do biopsji wykonaj otwory dostępu dla przewodów fluidycznych. Utwardź kolejną warstwę PDMS przez 20 minut w temperaturze 65°C.

Umieść przygotowaną warstwę górną na warstwie dolnej i utwardzaj przez noc w temperaturze 65 stopni. Oderwij płytki od szalki Petriego i pokrój w kostkę. Po wytworzeniu płytki są gotowe do użycia poprzez wprowadzenie interesujących rozwiązań.

Napełnij strzykawki wymaganymi roztworami, upewniając się, że w żadnych częściach przewodów nie pozostały pęcherzyki powietrza. Do generowania kropel wykorzystuje się dwie fazy. Wodna faza rozproszona zawiera interesujące badacza odczynniki.

Faza olejowa pełni rolę fazy ciągłej. Dopasuj rurki o tej samej średnicy wewnętrznej co końcówki igieł strzykawkowych do jednego końca igieł, zamontuj strzykawki w pompie strzykawkowej i ustaw żądany przepływ infuzyjny. Dla każdej fazy zaleca się minimalny stosunek przepływów fazy olejowej do wodnej równy jeden, aby uniknąć zwilżania PDMS przez fazę wodną, co prowadziłoby do niestabilnego tworzenia się kropel. Podłącz pozostałe końce rurek bezpośrednio do otworów wykonanych w podłożu z PDMS.

W przypadku bardziej złożonych rozwiązań można zastosować krzemionkę, porty kapilarne lub złącza. Należy połączyć port wyjściowy chipa z rurką i skierować ją do pojemnika na odpady lub do dalszej analizy. Po przygotowaniu układu można zastosować dwie główne konfiguracje mikrokanałów do generowania kropel: ogniskowanie przepływu lub złącze w kształcie litery T, co wynika z sił ścinania powstających przy wykorzystaniu tych geometrii do doprowadzenia dwóch dopuszczalnych cieczy oraz następującego po tym rozwoju niestabilności kapilarnych na ich styku.

Krople o objętości zaledwie kilku femtolitrów są generowane spontanicznie. Po ich wygenerowaniu można je badać za pomocą układu optycznego. System optyczny jest konfigurowany zgodnie z poniższym protokołem.

Należy użyć mikroskopu konfokalnego z automatycznym pozycjonowaniem submikronowym i laserem pracującym na długości fali odpowiadającej absorpcji stosowanych fluoroforów. W celu ich wzbudzenia należy zastosować laser impulsowy pracujący z częstotliwością powtarzania rzędu kilku megaherców do obrazowania czasu życia fluorescencji. W eksperymentach z plwociną wykorzystuje się lustra sterujące wiązką oraz optykę do kontroli wysokości oraz kierunku wiązki.

Użyj lustra dichroicznego, aby skierować wiązkę lasera do obiektywu. W przypadku jednoczesnego użycia dwóch laserów można zainstalować lustro dichroiczne dwupasmowe. Aby umożliwić odbicie obu wiązek laserowych, należy zastosować obiektyw mikroskopowy z korekcją do nieskończoności o wysokiej aperturze numerycznej NA, co pozwoli na uzyskanie wąskiego ogniska światła laserowego wewnątrz kanału mikroprzepływowego.

Zbierz fluorescencję emitowaną przez próbkę w kanale mikrofluidycznym, używając tego samego obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i transmitując ją przez to samo lustro dichroiczne. Usuń wszelkie pozostałości światła wzbudzenia za pomocą filtra emisyjnego pojedno- lub dwupasmowego. Skupuj emisję fluorescencji na otworze przypadkowym (pinhole) o średnicy 75 µm.

Przy użyciu soczewki plano-konweksyjnej. Należy umieścić otwór w płaszczyźnie konfokalnej obiektywu mikroskopu. Do rozdzielenia sygnału fluorescencyjnego na dwa detektory należy użyć drugiego lustra dichroicznego.

Przefiltruj fluorescencję odbitą od lustra dichroicznego za pomocą filtra emisyjnego i skup ją za pomocą soczewki plano-konweksyjnej na pierwszym detektorze. W przypadku eksperymentów z wykorzystaniem wtórnego fluoroforu czerwonego przefiltruj fluorescencję przenikającą przez lustro dichroiczne za pomocą innego filtra emisyjnego, a następnie skup ją za pomocą kolejnej soczewki plano-konweksyjnej na drugim detektorze. Do detekcji fotonów fluorescencji zastosuj fotodiody lawinowe.

W celu akwizycji danych fluorescencji należy sprzęgnąć sygnał elektroniczny z detektora fotodiody lawinowej z wielofunkcyjnym urządzeniem DAQ do rejestracji danych, obsługiwanym przez komputer osobisty. W przypadku eksperymentów z plwociną należy użyć lasera impulsowego i podłączyć detektory do karty PC do czasowo skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów (TCS), zainstalowanej w osobnym komputerze. Karta ta umożliwia uzyskanie danych dotyczących czasu życia fluorescencji.

Stosując metodologię TCS PC, każdy wykryty foton fluorescencyjny jest korelowany z padającym impulsem laserowym, w związku z czym każdemu wyemitowanemu fotonowi fluorescencyjnemu przypisuje się czas opóźnienia. Dane te można dopasować do pojedynczej lub wielokrotnej wykładniczej krzywej zaniku, aby uzyskać szacunkową wartość szybkości radiacyjnej fluoroforów.

Obecnie wiemy, że komórki są wysoce heterogeniczne pod względem biologicznym, fizycznym oraz chemicznym. W związku z tym w idealnym przypadku powinniśmy analizować każdą komórkę z osobna. Jednak analizy powinny być przeprowadzane przy zastosowaniu wysokiej przepustowości, abyśmy mogli zebrać wystarczającą ilość informacji ilościowych, pozwalających na sformułowanie wiarygodnych i istotnych wniosków.

Poniżej przedstawiono przykład enkapsulacji komórek e coli w pojedynczych kroplach w celu przeprowadzenia tej procedury. Należy użyć szczepu e coli top 10 hodowanego przez noc. Do oznaczenia żywotności komórek należy zastosować cyto nine oraz jodek propidyny.

Oba barwniki są interkalatorami DNA, a ich intensywność fluorescencji wzrasta ponad 20-krotnie. Po związaniu z DNA cyto nine jest zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, który przenika przez błony komórkowe, natomiast jodek propidynyum to czerwony barwnik fluorescencyjny, który nie przenika przez błony komórkowe.

W związku z tym żywe komórki fluorescują na zielono, natomiast martwe komórki wykazują emisję zarówno zieloną, jak i czerwoną. Tutaj możemy zobaczyć generowanie kropel oraz enkapsulację pojedynczej komórki za pomocą złącza T. Film ten został nagrany kamerą wysokich prędkości, jednak krople mogą być generowane z częstotliwością tysięcy na sekundę.

Podczas enkapsulacji komórek należy upewnić się, że hodowla komórkowa jest rozcieńczona w taki sposób, aby liczba komórek była mniejsza niż liczba generowanych kropli, oraz że zapobieżono sedymentacji komórek, która może wystąpić w strzykawce lub przewodach. Wewnątrz strzykawki należy zastosować magnetyczny mieszadło, aby utrzymać równomierny rozkład komórek w roztworze. Do połączenia strzykawki z mikroczipem należy użyć bardzo cienkich przewodów o średnicy 50 micrometers.

Zapewnia to szybki przepływ wewnątrz rurki, co zapobiega sedymentacji komórek. Poniżej przedstawiono typowe przykłady liczby fotonów w funkcji czasu dla eksperymentów z wykorzystaniem komórek. Służy to do mapowania procesów mieszania wewnątrz kropli.

Krople można generować przy użyciu dwóch różnych fluoroforów o różnych czasach życia. Wewnątrz przepływającej kropli powstaje pole przepływu, które ostatecznie miesza dwa pierwotnie rozdzielone roztwory, aby usprawnić proces mieszania. Symetrię pola przepływu można zmienić, stosując kręte kanały.

W celu zbadania kropli należy skupić objętość sondy optycznej na wysokości połowy mikrokanału, wzdłuż którego przepływają krople, zaczynając od jednej strony kanału i przeprowadzając każdy eksperyment wzdłuż całej szerokości kanału w odstępach jednego mikrometra. Należy wdrożyć algorytm pozwalający odróżnić pojedyncze impulsy związane z kroplami od tła szumów fazy olejowej oraz określić czas trwania każdego impulsu.

Zaimplementuj drugi algorytm w celu wyodrębnienia wartości czasu opóźnienia oraz intensywności wzdłuż długości każdej kropli przy konkretnej szerokości, dla której przeprowadzono eksperyment. Następnie wykorzystaj algorytm estymacji największej wiarygodności (MLE), aby ocenić czas życia fluorescencji każdej kropli w eksperymencie. Uśrednienie wartości czasu życia dla wszystkich kropli w eksperymencie pozwala zredukować końcowy błąd obliczeń MLE.

Im więcej kropli zostanie przebadanych, tym mniejszy będzie błąd po uzyskaniu trajektorii czasu życia. Dla każdej szerokości należy połączyć wszystkie trajektorie na mapie 2D. Ponieważ każda wartość czasu życia jest powiązana z konkretną mieszanką dwóch fluorescencji, można w ten sposób uzyskać mapę stężeń lub mieszania.

Opisaliśmy wykonanie urządzenia mikroprzepływowego oraz zestawu eksperymentalnego wraz z powiązanymi protokołami tworzenia mikrokropli, enkapsulacji obszarowej oraz optycznej detekcji kropel w tym procesie. Wybrano dwa przykłady: detekcję pojedynczych komórek w kroplach oraz mapowanie procesów mieszania wewnątrz płynącej kropli, które stanowią typowe zastosowania obecnie badane w ramach mikrofluidyki kropelkowej.

Jak pokazują przedstawione eksperymenty, zastosowanie platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach wykazuje pewne atrakcyjne cechy, takie jak wysoka przepustowość wynikająca z doskonałego ograniczenia przestrzennego oraz większa powtarzalność. Duża ilość generowanych informacji oraz najwyższa prędkość ich powstawania wymagają zastosowania szybkich metod detekcji o najwyższej rozdzielczości przestrzenno-czasowej, aby w pełni wykorzystać zalety tych zminiaturyzowanych platform.

W tym przypadku wykazujemy, że jest to możliwe dzięki zastosowaniu wysoce precyzyjnych technik spektroskopii fluorowej.