Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce
14 listopada 2011
Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.
Ogólnym celem tej procedury jest badanie odpowiedzi na światło oraz morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce z wykorzystaniem linii myszy wykazującej ekspresję markera fluorescencyjnego wyłącznie w określonych typach komórek. Cel ten osiąga się najpierw poprzez wypreparowanie oka w celu uzyskania izolowanej siatkówki. Drugim krokiem jest umieszczenie siatkówki pod laserowym mikroskopem skaningowym i wizualizacja komórki za pomocą dwufotonowej ekscytacji podczerwienią.
Następnie używa się mikropipety, aby uzyskać konfigurację whole cell patch clamp w celu rejestracji i wypełnienia barwnikiem. Ostatecznie preparat ten pozwala na rejestrację odpowiedzi komórkowych na fotostymulację oraz ujawnia morfologię rejestrowanej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak niekierowana rejestracja patch clamp z siatkówki, jest możliwość wizualnego skierowania rejestracji na komórkę znakowaną fluorescencyjnie bez stymulowania siatkówki światłem wzbudzenia.
Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad siatkówką, takie jak: jaki jest wkład danej populacji komórek w przetwarzanie informacji wizualnych? Ma to zastosowanie nawet wtedy, gdy populacja komórek charakteryzuje się niską gęstością i nie posiada wyraźnych cech morfologicznych, które mogłyby ułatwić identyfikację. Eksperyment należy rozpocząć od adaptacji myszy do ciemności przez co najmniej trzy godziny przed badaniem.
W międzyczasie przygotować roztwór pozakomórkowy zgodnie z opisem w załączonym manuskrypcie i napowietrzać go karbogenem w temperaturze pokojowej. Następnie uśmiercić mysz i przeprowadzić enukleację gałek ocznych za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki. Przenieść je do naczynia z roztworem pozakomórkowym.
Następnie umieść próbkę pod mikroskopem stereoskopowym i użyj sprężynowych nożyczek chirurgicznych. Usuń rogówkę oraz ciało rzęsiste, rozcinając gałkę oczną wzdłuż ora serrata. Wyjmij soczewkę i ostrożnie oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego.
Następnie przetnij nerw wzrokowy pomiędzy siatkówką a nabłonkiem barwnym. Usuń siatkówkę z oczodołu. Zwróć uwagę, że wewnętrzna strona zwiniętej siatkówki to strona komórek zwojowych.
Strona zewnętrzna to strona fotoreceptorów. Następnie należy usunąć ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki, delikatnie odrywając je za pomocą drewnianego wykałaczki. Następnie wykonuje się krótkie nacięcia wzdłuż obwodu siatkówki, aby ułatwić spłaszczenie tkanki.
Następnie przenieś siatkówkę do komory rejestracyjnej stroną fotoreceptorów skierowaną w dół. Rozprostuj ją na szklanym dnie za pomocą cienkiego pędzla i unieruchom za pomocą ramki ze stali nierdzewnej z nylonowymi nićmi. Umieść komorę rejestracyjną w ciemności pod odwróconym mikroskopem laserowym ze skanowaniem.
Płucz preparat siatkówki w sposób ciągły, z przepływem nie mniejszym niż 5 ml/min. Wykorzystując nasycony tlenem roztwór zewnątrzkomórkowy podgrzany do 35 °C, mikroskop należy ustawić na amortyzowanym stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya. W celu zapewnienia ekranowania elektronicznego, przykryj klatkę nieprzezroczystą zasłoną, aby utrzymać preparat w ciemności.
Ekranujemy również światło z monitorów komputerowych za pomocą czerwonych przezroczystych folii. Nastroimy laser podczerwony na zakres od 850 do 870 nanometrów lub dłuższe fale. Przełączamy urządzenie w tryb blokady modów i wykorzystujemy dwufotonową ekscytację w celu wizualizacji komórek ekspresujących GFP.
W celu przeprowadzenia rejestracji metodą patch clamp, należy napełnić mikropipety z borokrzemianu szkła roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym sondę fluorescencyjną, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Następnie należy umieścić mikropipetę w uchwycie. Należy upewnić się, że elektroda odniesienia znajduje się w kontakcie z roztworem zewnątrzkomórkowym w komorze rejestracyjnej.
Następnie, za pomocą obiektywu imersyjnego 40x, wywarcie nacisk na komórkę docelową A GFP za pomocą mikropipety. Ciała komórek Omicron znajdują się w warstwie komórek zwojowych oraz w proksymalnej części warstwy międzypleksiformej; przed kontaktem mikropipety z docelową komórką należy przebić wewnętrzną błonę ograniczającą na powierzchni siatkówki. Prawidłowe przebicie rozpoznaje się po wypłynięciu roztworu wewnątrzkomórkowego z końcówki mikropipety oraz oddzieleniu wewnętrznej błony ograniczającej od leżącej pod nią tkanki siatkówki. Barwnik fluorescencyjny zawarty w roztworze wewnątrzkomórkowym może ujawnić pozycję mikropipety na obrazie dwufotonowym podczas zbliżania się do wybranej komórki.
Następnie zwolnić nacisk z mikropipety i uzyskać konfigurację whole-cell patch clamp. W trybie current clamp prawidłowy zapis powinien wykazywać potencjał błony od -50 do -55 mV i trwać co najmniej 20 minut. Po tym czasie zaprezentować bodźce wizualne wygenerowane na monitorze komputera.
Dostosuj intensywność bodźca, wstawiając filtry neutralne do drogi wiązki, i ustaw pozycję przestrzenną stymulacji na środek rejestrowanej komórki. Następnie uruchom protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedzi świetlne. Użyj generatora bodźców do wyzwalania oprogramowania rejestrującego.
W ścieżce wiązki należy umieścić fotodiodę w celu rejestracji czasu podawania bodźca. Należy uważać, aby nie wyciągnąć ciała komórki podczas wycofywania mikropipety. Po zakończeniu wypełniania barwnikiem należy pozwolić substancji fluorescencyjnej dyfundować do rejestrowanej komórki przez 30 do 45 minut.
Oto przykład komórek wykazujących ekspresję GFP w preparacie płaskim siatkówki pod promotorem dla hydroksylazy tyrozynowej; można wyróżnić dwie populacje na podstawie intensywności sygnału GFP. Komórki dopaminergiczne typu pierwszego, zlokalizowane w warstwie prześwietlnej, wykazują słabą fluorescencję, co wskazują groty strzałek na rysunku A. Komórki typu drugiego zostały intensywnie znakowane i posiadają ciała komórkowe albo w tej samej warstwie, jak pokazują strzałki na rysunku A, albo przesunięte do warstwy komórek zwojowych, co przedstawiono na rysunku B. Rysunek C pokazuje stratyfikację dendrytyczną komórek typu drugiego w trzeciej warstwie wewnętrznej warstwy splotowej; przedstawiony tutaj przykład ukazuje morfologię komórki typu drugiego wstrzykniętej z tracerem neurobiotyną.
Marker został następnie zwizualizowany poprzez wiązanie ze znakowaną fluorescencyjnie streptawidyną, przedstawioną tutaj w kolorze purpurowym. Poniżej przedstawiono różne wzorce odpowiedzi komórki typu drugiego znajdującej się w warstwie komórek zwojowych na światło białe. W celu lepszego rozróżnienia komponentów odpowiedzi w momencie rozpoczęcia i zakończenia bodźca, po zastosowaniu powytej procedury, wykorzystano przedłużony bodziec trwający trzy sekundy.
W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalna rola danego typu komórek w obrębie obwodów siatkówki, można przeprowadzić inne metody, np. eksperymenty farmakologiczne, obrazowanie wapnia lub immunochemię.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę rejestracji odpowiedzi świetlnych i morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy z wykorzystaniem dwufotonowego wzbudzenia podczerwienią. Technika ta umożliwia celowaną rejestrację metodą patch-clamp z komórek znakowanych fluorescencyjnie, co usprawnia badanie funkcji siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Badania nad siatkówką
Wstęp
- Zrozumienie odpowiedzi neuronalnych w siatkówce jest kluczowe dla badań nad przetwarzaniem informacji wzrokowych.
- Markery fluorescencyjne umożliwiają identyfikację specyficznych typów komórek.
- Tradycyjne metody mogą nie pozwalać na precyzyjne celowanie w komórki.
- Celem niniejszego badania jest poprawa dokładności rejestracji sygnałów z określonych populacji neuronów.
Cel badania
- W celu zbadania odpowiedzi pojedynczych neuronów siatkówki na światło.
- W celu przeanalizowania morfologii rejestrowanych neuronów.
- W celu pogłębienia zrozumienia przetwarzania informacji wizualnych przez specyficzne populacje komórek.
Zastosowane metody
- Disekcja oka myszy w celu wyizolowania siatkówki.
- Wizualizacja komórek z wykorzystaniem dwufotonowego wzbudzenia podczerwienią.
- Rejestracja metodą patch-clamp w celu uzyskania odpowiedzi komórkowych.
- Wypełnianie barwnikiem w celu ukazania morfologii komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Główne wyniki
- Pomyślne rejestracje odpowiedzi świetlnych z wybranych, znakowanych fluorescencyjnie neuronów.
- Szczegółowe informacje morfologiczne dotyczące struktury rejestrowanych komórek.
- Wykazane zalety targetowania wizualnego w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Technika ta stanowi potężne narzędzie do badania neuronów siatkówki.
- Pozwala ona badaczom na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji siatkówki i przetwarzania bodźców wzrokowych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu eksploracji innych populacji neuronalnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ukierunkowana rejestracja elektrofizjologiczna specyficznych populacji neuronów w nienaruszonym tkankach rozwiązuje kluczowy problem w procesie odkrywania leków w neuronauce: powiązanie funkcji komórkowych z zachowaniem obwodów neuronalnych. Umożliwiając precyzyjny dostęp do komórek o niskiej liczebności lub niejednoznacznej morfologii, metoda ta zwiększa pewność walidacji celów terapeutycznych i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Stanowi ona pomost translacyjny dla oceny, w jaki sposób modulacja określonych podtypów neuronów wpływa na przetwarzanie sensoryczne, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych w zakresie terapii zaburzeń sensorycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów w celu walidacji celów terapeutycznych w obwodach sensorycznych.
- Wartość operacyjna: Redukuje odsetek wyników fałszywie ujemnych w badaniach przesiewowych celów poprzez poprawę dostępu do rzadkich lub słabo scharakteryzowanych typów komórek.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty elektrofizjologiczne (np. prądy wywołane światłem, zmiany potencjału błony) w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Wspiera powtarzalne, prowadzone wizualnie procedury patch-clamp, kompatybilne z zautomatyzowanymi platformami mikroskopowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Powiązana z fenotypami komórkowymi odpowiedź siatkówki, umożliwiająca ocenę wpływu oddziaływania na cel na przetwarzanie sygnałów wizualnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną korelację morfologii z funkcją poprzez wypełnianie barwnikiem po rejestracji i obrazowanie konfokalne.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z biologią odkrywczą, umożliwiając badanie podtypów neuronów w oparciu o postawione hipotezy, wspierając identyfikację związków wiodących poprzez screening funkcjonalny oraz dostarczając informacji do walidacji przedklinicznej za pomocą korelacji struktura-funkcja.
- Biologia odkrywcza: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie bezpośredniego pomiaru odpowiedzi neuronalnych na światło w preparatach dostępnych genetycznie.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, wywołanych bodźcem profili elektrofizjologicznych, które mogą być testowane pod kątem działania związków chemicznych w sposób ukierunkowany.
- Analityka: Zapewnia ilościowe zmienne zależne, takie jak częstotliwość impulsów, amplituda prądu i kinetyka, do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy morfologię subkomórkową (poprzez wypełnianie barwnikiem) z fenotypem elektrofizjologicznym, wspierając dopasowanie biomarkerów w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do badania dowolnej populacji neuronów zdefiniowanej przez GFP w różnych warstwach siatkówki i paradygmatach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celów poprzez redukcję niejednoznaczności w zakresie wkładu komórkowego w funkcję obwodu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym etapom wizualizacji, rejestracji i walidacji morfologicznej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając dane funkcjonalne o celach, które w przeciwnym razie byłyby niedostępne za pomocą ślepej elektrofizjologii.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii sensorycznych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane mechanizmy komórkowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii dwufotonowej, elektrofizjologii oraz preparowania tkanki siatkówki.
- Zależne od systemów laserów podczerwonych, wzmacniaczy patch-clamp oraz utrzymania perfuzji w temperaturze fizjologicznej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów barwienia, celowania i dostarczania bodźców pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych wymaga walidacji specyficzności promotora oraz właściwości optycznych tkanki.
- Ograniczone przez ryzyko fototoksyczności przy wysokiej mocy lasera oraz ograniczenia żywotności podczas przedłużonej superfuzji zewnątrzkomórkowej.
