Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca²⁺ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja sygnałowania wapniowego w naczyniach krwionośnych wywołanego przez reaktywne formy tlenu (ROS) pochodzenia perykrynnego. Osiąga się to poprzez wstępną wizualizację ROS z wykorzystaniem barwników wrażliwych na utlenianie w aktywnych makrofagach. ROS można również wizualizować w komórkach śródbłonka przy użyciu fluorescencyjnych sensorów opartych na plazmidach.

Następnie należy przejść do jednoczesnej wizualizacji makrofagów aktywowanych, znakowanych barwnikiem Cell Tracker Red, oraz komórek śródbłonka znakowanych barwnikiem Fluo-4 w modelu kokultury. Na koniec, przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego, należy zmierzyć sygnalizację wapniową w komórkach śródbłonka wywołaną przez ROS pochodzące z makrofagów.

Wyniki te mogą wykazać poziomy ROS niezależnie, a także jednocześnie ocenić wewnątrzkomórkową mobilizację wapnia wywołaną przez ROS pochodzące z Peregrine. Metoda ta umożliwia jednoczesną ocenę dwóch różnych cząsteczek sygnałowych, które ściśle wywołują sygnalizację naczyniową i symulują warunki patofizjologiczne. Dwaj postdoktoranci z mojego laboratorium, Karthik i Raj, zademonstrują procedurę pomiarów ROS i wapnia oraz interakcje między makrofagami a komórkami śródbłonka.

Hoduj makrofagi pochodzące z monocytów mysich na szalkach 35 mm z szklanym dnem. Następnie stymuluj komórki agonistami receptorów Toll-podobnych i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 °C. W celu wizualizacji cytozolu.

W celu oznaczenia ROS należy dodać barwnik wrażliwy na utlenianie i inkubować komórki przez 20 minut. Następnie należy przeprowadzić wizualizację komórek na stole z kontrolą temperatury w systemie obrazowania konfokalnego. Alternatywnie, aby zwizualizować mitochondrialne ROS w komórkach aktywowanych TLR, należy dodać wskaźnik mitochondrialnego anionorodnika ponadtlenkowego i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

W celu uzyskania kontroli negatywnej potraktuj komórki roztworem PBS, a dla kontroli pozytywnej DMSO. Potraktuj komórki 2 mM antymycyny. Następnie przystąp do wizualizacji wszystkich komórek na stole z kontrolą temperatury w systemie obrazowania konfokalnego.

Przy użyciu oprogramowania ImageJ przeanalizuj wszystkie dane obrazowe. Sensor fluorescencyjny hyper specyficznie wykrywa submikromolarne stężenia nadtlenku a na podstawie ekspresji w komórkach ssaków, projekt wektora może być skierowany do cytoplazmy lub mitochondriów. Wykorzystując elektroporację, stwórz stabilne linie mysich komórek śródbłonka mikrokrążenia płucnego niosące odpowiedni plazmid do nadekspresji hyper.

Aby ułatwić wzrost kolonii, wysiej komórki o niskiej gęstości na płytki w pełnym medium TMEM i inkubuj przez 48 godzin, a następnie wymień medium na pełne medium hodowlane uzupełnione o antybiotyk selekcyjny. Przesiej klony w celu wyłonienia tych o najwyższym odsetku komórek hiperpozytywnych i namnóż hodowlę, aby stworzyć stabilne linie hiperpozytywne do poszczególnych eksperymentów. Wysiej komórki na szkiełka podstawowe pokryte 0,2% żelatyną i hoduj przez noc do osiągnięcia 80% konfluencji.

Następnie aktywuj komórki ligandami TLR i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37°C. W celu detekcji cytoplazmatycznych ROS zamocuj szkiełka podstawowe z komórkami w komorze do hodowli komórek Adelo. Dodaj 1 mL podgrzanego roztworu soli zbuforowanego według Hanksa i umieść komorę na stoliku z kontrolą temperatury w konfokalnym systemie obrazowania.

Zarejestruj zmiany fluorescencji w komórkach w celu wykrycia mitochondrialnych ROS. Uwzględnij kontrolę pozytywną z zastosowaniem 2 µM antymycyny A. Następnie przygotuj szkiełka podstawowe z traktowanymi komórkami do mikroskopii konfokalnej. Przeprowadź analizę obrazów przy użyciu oprogramowania ImageJ.

Zacznij od komórek śródbłonka wyhodowanych do 80% konfluencji na szklanych szkiełkach podstawkowych pokrytych żelatyną w celu wizualizacji i pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian stężenia wapnia. Inkubuj komórki w barwniku fluorescencyjnym Fluo-4 AM w temperaturze pokojowej przez 30 minut; aby zminimalizować utratę barwnika, przemyj komórki eksperymentalnym roztworem obrazującym zawierającym Pluronic F-127. Następnie zamocuj szkiełka w komorze do hodowli komórek Adelo, dodając 800 µL uprzednio ogrzanego eksperymentalnego roztworu obrazującego, i umieść komórki na stoliku z kontrolą temperatury w konfokalnym systemie obrazowania, korzystając z oddzielnej probówki.

Użyj 500 ng/mL znacznika komórkowego cell tracker red C-M-T-P-X przez 15 minut w celu oznakowania badanej populacji makrofagów, a następnie przemyj komórki i zawieś osady w 200 µL eksperymentalnego roztworu obrazującego. Następnie dodaj oznakowane makrofagi do obciążonych Fluo-4 AM komórek śródbłonka w zestawie komory konfokalnej. Rejestruj fluorescencję zieloną i czerwoną co trzy sekundy przez 10 minut.

W tym doświadczeniu komórki J 7 74 0.1 poddano działaniu ligandów TLR 2, 3 i 4 przez sześć godzin. Reprezentatywne obrazy konfokalne wykazują zwiększony poziom ROS w cytozolu, zmierzony za pomocą DCF. Co ciekawe, czerwona fluorescencja MitoSOX wskazuje na podobny wzrost poziomu ROS w mitochondriach.

Zmiany fluorescencji te mają charakter ilościowy. W związku z tym wyniki muszą zostać znormalizowane i wyrażone jako względna krotność zmiany dla każdego wariantu traktowania; sygnał antymycyny A służy jako walidacja kontroli pozytywnej dla produkcji mitochondrialnych ROS. Rycina ta przedstawia obrazy poziomów nadtlenku w komórkach endotelialnych, cytozolu oraz mitochondriach w liniach stabilnie eksponujących hyper cyto lub hyper D mito.

Komórki MP ECS stymulowane agonistami TLR. Ilościowe określenie zmiany średniej fluorescencji wykazuje wzrost fluorescencji hyper cyto oraz hyper D mito po sześciu godzinach stymulacji w systemie ko-kultury. Aby ocenić sygnalizację Peregrine ROS, świeżo wyizolowane makrofagi mirin pochodzące zarówno od myszy typu dzikiego, jak i myszy z nokautem GP 91 Fox, aktywowano za pomocą 1 µg/mL LPS przez sześć godzin.

Makrofagi znakowano na czerwono za pomocą C-M-T-P-X i dodawano do naładowanych zieloną fluorescencją MPM ecs. Co ciekawe, makrofagi aktywowane LPS wyizolowane z myszy typu dzikiego wywołały silną i szybką mobilizację wapnia w MPM ECS w porównaniu z makrofagami z myszy GP 91 Fox null.

Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że zarówno przedłużone naświetlanie, jak i ekspozycja na laser prowadzą do autooksydacji DCF. Kluczowe jest uniknięcie fotowyblakania hyper cyto oraz hyper D mitral. Po opanowaniu techniki pomiar RA w makrofagach, jak i w komórkach śródbłonka, może zostać przeprowadzony w ciągu siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.