Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie wpływu obciążenia mechanicznego na proteolityczne cięcie pojedynczych białek w sposób wysoce równoległy i efektywny kosztowo. W niniejszej demonstracji badane jest cięcie kolagenu przez metaloproteinazę macierzy 1; w pierwszym kroku do szkiełka nakrywkowego celi przepływowej mocowane są uchwyty do kolagenu, a następnie do poszczególnych cząsteczek kolagenu przytwierdza się magnetyczne kulki o rozmiarach mikrometrycznych. Drugim krokiem jest montaż celi przepływowej w aparaturze do pęset magnetycznych oraz sprawdzenie, czy z powierzchni szkiełka nakrywkowego usunięto kulki przyłączone nieswoiście.

Następnie proteazę dodaje się do komór przepływowych. Ostatnim krokiem jest określenie szybkości proteolizy poprzez monitorowanie odrywania się kulek w czasie rzeczywistym. Poprzez pomiar szybkości odrywania się kulek przy różnych stężeniach proteazy i siłach, możliwe jest wyprowadzenie standardowych zoologicznych parametrów kinetycznych przy użyciu minimalnych ilości substratu i proteazy.

Dodatkowo technika ta dostarcza unikalnych informacji na temat wpływu siły mechanicznej na szybkość proteolizy oraz na zmiany strukturalne w białku substratowym, które towarzyszą rozszczepieniu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak optyczne ślady T oraz mikroskopia sił atomowych, jest jej wysoka przepustowość i efektywność kosztowa. Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w efektywną siłę oddziałującą na proteolityczne rozszczepienie pojedynczych białek, zastosowana aparatura i techniki mogą zostać wykorzystane w szerokim zakresie problemów biofizycznych, w tym do badania wpływu siły na zwijanie i konformację białek.

Przygotowanie celi przepływowej należy rozpocząć od oczyszczenia szkiełek podstawowych za pomocą sonikacji. Umieść szkiełka w niewielkim szklanym pojemniku, który mieści się w myjce ultradźwiękowej. Napełnij pojemnik izopropanolem i poddaj sonikacji w kąpieli przez 20 minut, a następnie usuń izopropanol i wypłucz szkiełka obfitą ilością wody dejonizowanej.

Napełnić pojemnik wodą i poddać sonikacji przez 20 minut. Po sonikacji osuszyć szkiełka podstawowe strumieniem przefiltrowanego, wolnego od pyłu powietrza. Sprawdzić stan szkiełek i użyć wyłącznie tych, które nie mają smug.

Delikatnie opal szkiełka nakrywkowe przez kilka sekund, aby oczyścić je z pozostałego kurzu i wilgoci, przesuwając je przez płomień palnika Bunsena; należy przy tym uważać, aby nie odkształcić szkiełka w wyniku nadmiernego nagrzania. Krok ten pozwala usunąć pozostałe zanieczyszczenia powierzchniowe.

Następnie należy użyć dwustronnej taśmy klejącej, aby połączyć ze sobą dwa szkiełka nakrywkowe. Po odcięciu kawałka taśmy o długości około trzech centymetrów i szerokości 0,3 centymetra, przykleja się ją do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 40 milimetrów, pozostawiając w środku kanał o szerokości 1,6 centymetra. Należy użyć końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe i upewnić się, że taśma prawidłowo przylga.

Aparat do pęsety magnetycznej został skonstruowany w naszym laboratorium z wykorzystaniem aluminiowego kątownika z otworem o średnicy 1 mm i zamontowany na pionowym translatatorze osi Z w celu regulacji wysokości pęsety. Dwa trwałe magnesy ziemi rzadkich przymocowano do kątownika po obu stronach otworu, aby wytworzyć gradient pola magnetycznego. Prawidłowa kalibracja pułapki magnetycznej jest niezbędna w tej procedurze.

Aby zapewnić sukces, stosujemy dwie różne metody opisane w tej sekcji. W celu kalibracji pułapki magnetycznej należy użyć wcześniej przygotowanego DNA z faga Lambda, znakowanego na końcach 5' i 3' biotyną i digoksygeniną, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby przytwierdzić DNA do celi przepływowej, najpierw należy wypełnić celę roztworem przeciwciał anty-digoksygenina i pozostawić przeciwciała do przywierania do szklanej powierzchni przez 15 minut.

Następnie należy zablokować powierzchnię komory przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu przywieraniu DNA, dodając do niej roztwór BSA. Należy pamiętać, że w tym etapie blokowania oraz we wszystkich kolejnych krokach objętość odczynnika dodawana do komory przepływowej powinna być co najmniej dwukrotnie większa niż objętość komory. Przy objętości komory przepływowej wynoszącej w tej demonstracji 75 µL, inkubuj komorę w temperaturze pokojowej przez 45 minut.

Po powtórzeniu tego kroku dodaj 50 pM funkcjonalizowanego DNA lambda i pozostaw je na 15 minut w celu przytwierdzenia do szkiełka podstawowego, a następnie wypłucz nadmiar DNA za pomocą jednego roztworu XPBS. Na koniec dodaj superparamagnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną i pozostaw je na 15 minut, aby przyłączyły się do unieruchomionego DNA. W tym pokazie zastosowano kuleczki o rozmiarze 2,8 µm.

Wypłucz nadmiar kulek za pomocą XPBS. Następnie przeprowadź kalibrację pęset magnetycznych, przesuwając magnesy trwałe do pozycji oddalonej od powierzchni próbki. Następnie umieść przygotowaną komorę przepływową w mikroskopie.

Przesuń magnesy trwałe w pozycję nad celą przepływową. Wybierz płaszczyznę ogniskowania kulek funkcjonalizowanych DNA Lambda, ustawiając ostrość na kulki z dala od obu szklanych powierzchni. Prawidłowa płaszczyzna ogniskowania to taka, w której poszukiwane kulki mają jasne centrum.

Nagraj film z ruchu kulek z częstotliwością powyżej 80 Hz przez 500 klatek. Przesuwaj magnes bliżej powierzchni próbki i nagrywaj film z ruchu kulek dla każdej pozycji. Dla odległości powyżej pięciu milimetrów przesuwaj magnes w odstępach jednego milimetra dla odległości między jednym a pięcioma milimetrami.

Przesuwaj w przyrostach 0.5 millimeter dla odległości mniejszych niż jeden millimeter, a w przyrostach 0.25 millimeter dla mniejszych. Dla każdego zestawu danych śledź środek kuleczek, stosując dopasowanie Gaussa 2D. Oblicz siłę poprzez fluktuacje brownowskie, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. Potwierdź dokładność sił, sprawdzając obliczenia siły za pomocą dopasowania liniowego widma mocy.

Aby wyznaczyć częstotliwość odcięcia, należy zapoznać się z zależnością między przyłożoną siłą a częstotliwością odcięcia opisaną w tekście. Przed przytwierdzeniem peptydów kolagenu do cel wypełniających układ przepływowy, należy wyekspresować i oczyścić białka peptydowe kolagenu oraz MMP1. Rozpocząć należy od dodania roztworu przeciwciała anty-Myc do celi przepływowej i inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić przytwierdzenie przeciwciała anty-Myc do powierzchni celi. Następnie zablokować celę przepływową, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu białek, używając BSA w stężeniu 5 mg/mL. Dodać 150 pM peptydu kolagenu i pozostawić na 45 minut, aby przytwierdził się on do przeciwciała za pomocą znacznika Myc.

Nadmiar kolagenu należy wypłukać buforem PBS przed wprowadzeniem kuleczek o średnicy 2,8 µm do komory przepływowej. Powinny one zostać oddzielone od roztworu kuleczek pokrytych streptawidyną za pomocą silnych magnesów, a następnie resuspenderowane w PBS. Proces ten należy powtórzyć trzykrotnie.

Krok ten jest niezbędny, aby koraliki o średnicy 2,8 µm związały się z unieruchomionym na powierzchni peptydem kolagenowym. Następnie należy dodać superparamagnetyczne koraliki pokryte streptawidyną i pozostawić je na 45 minut, aby przyłączyły się do cząsteczek kolagenu. Po zmontowaniu komory przepływowej z peptydem kolagenowym i koralikami magnetycznymi, należy wykonać obrazowanie komory przepływowej w pułapce magnetycznej.

Przy niskiej sile część kulek bywa słabo związana, przylegając do powierzchni w sposób nieswoisty. Przyłożenie umiarkowanej siły zapewnia uwolnienie tych kulek. Do komory przepływowej należy dodać aktywowany enzym.

W tym przypadku MMP1 został uprzednio aktywowany poprzez dodanie 3,5 mM PMA i inkubowany w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Po ponownym wprowadzeniu komory przepływowej do aparatu z pęsetami magnetycznymi, należy nagrać wideo obejmujące kilka pól widzenia, co zazwyczaj pozwala na uzyskanie obrazu kilkuset przytwierdzonych kuleczek. Pomiar ten odpowiada czasowi t = 0.

Powtarzaj proces rejestrowania kilku pól widzenia w regularnych odstępach czasu, aż wszystkie koraliki odłączą się lub do momentu, gdy nie będzie już dostrzegalna dalsza proteoliza. Pincety magnetyczne zostały skalibrowane dla koralików o średnicy 1 µm oraz 2,8 µm. Wykorzystując zarówno amplitudę obserwowanych fluktuacji brownowskich, jak i obliczenie częstotliwości odcięcia przy różnych pozycjach magnesu w eksperymentach z wymuszoną proteolizą, można wykreślić znormalizowaną liczbę pozostałych koralików jako funkcję czasu, aby wyznaczyć szybkość proteolizy.

Proces ten można powtarzać dla różnych stężeń enzymu i sił. Szybkość proteolizy zależy od przyłożonej siły. Szybkości proteolizy określono dla wartości 1 pN, 6,2 pN oraz 13 pN.

Ułamek koralików nieprzepuszczających dla czasu powyżej 15 minut pozostaje stały na poziomie około 0,25 w różnych eksperymentach. W naszym przypadku test pozwolił nam zmierzyć wydajność katalityczną MMP1 w zależności od przyłożonej siły. Analiza danych wykazała, że potrójna helisa kolagenu musi ulec lokalnemu rozpleceniu przed proteolizą.

Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Należy pamiętać, że aby uzyskać dobrą istotność statystyczną danych, wymagane jest co najmniej 30 do 50 kulek w polu widzenia. Proszę nie zapominać, że PMA może być niezwykle niebezpieczny, dlatego podczas przeprowadzania tego eksperymentu należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak rękawiczki, fartuchy laboratoryjne i maski ochronne.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru wpływu siły na proteolityczne cięcie pojedynczych białek przy użyciu pęset magnetycznych. Pęsety magnetyczne są doskonałym narzędziem do zrozumienia biofizycznych eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach. Technikę tę można rozszerzyć na inne kombinacje proteaz i substratów.

Ponadto podobne techniki można wykorzystać do badania dynamiki strukturalnej białek, a także do analizy innych białek, które wiążą lub modyfikują RNA i/lub DNA.