Rozciąganie krótkich sekwencji DNA za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile

Ogólnym celem niniejszej procedury jest manipulowanie krótkimi cząsteczkami DNA o długości 100 nanometrów przy użyciu stałych, dobrze skalibrowanych sił optycznych. Osiąga się to poprzez przywiązanie jednego końca DNA do szkiełka podstawowego, a drugiego do polistyrenowej mikrosfery. Następnie przeprowadza się wyrównanie i kalibrację pęsety optycznej.

Następnie DNA jest odciągane od powierzchni poprzez kombinację sił gradientu i sił rozproszonych działających na mikrosferę. Na koniec DNA zostaje rozciągnięte poprzez uwięzienie kuleczki w liniowym obszarze potencjału. Protokół ten był wykorzystywany do badania właściwości mechanicznych DNA oraz kinetyki wiązania białek do DNA, a ponadto okazał się pomocny w wyjaśnianiu znaczenia warunków brzegowych dla elastyczności krótkich konstruktów DNA.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważy wyrównanie i kalibracja optycznych pęset o stałej sile są procesami trudnymi i złożonymi. Pęsety optyczne wykorzystują wiązkę z lasera o długości fali 1064 nanometr, która jest dzielona na dwie wiązki o ortogonalnej polaryzacji. Jedna z nich służy do manipulowania biomolekułą, a druga do celów kalibracyjnych.

Intensywność wiązki manipulacyjnej jest kontrolowana przez akustyczno-optyczny (AO) deflektor lub OD. Następnie wiązki są ponownie łączone za pomocą innego polaryzacyjnego rozdzielacza wiązki. Wiązki są silnie ogniskowane na komorze z próbką przez obiektyw mikroskopu imersyjnego plan APO 60 x 1,4 w oleju. Ten układ pęsety optycznej jest połączony z własnoręcznie zbudowanym mikroskopem w polu jasnym, który zapewnia oświetlenie z lampy halogenowej ogniskowanej na komorze z próbką przez kondensor.

Obraz w jasnym polu jest oddzielany od światła laserowego za pomocą lustra dichroicznego, a następnie obrazowany na dwóch kamerach CCD. Jedna kamera CCD służy jako główny instrument do pozyskiwania danych i jest wyzwalana programowo w celu zapewnienia precyzyjnych częstotliwości próbkowania. Druga kamera CCD jest wykorzystywana do obrazowania pojedynczej, unieruchomionej mikrosfery referencyjnej, której pozycja służy jako system sprzężenia zwrotnego do kompensacji dryftu mikroskopu.

Próbkę wstępnie pozycjonuje się względem obiektywu za pomocą stolika XY, a następnie można ją precyzyjnie ustawić za pomocą wbudowanego trójwymiarowego stolika piezoelektrycznego. Rozproszone do przodu oraz przechodzące światło laserowe jest zbierane przez kondensator w jasnym polu i ogniskowane na fotodetektorze w celu kalibracji rozmiaru kulek; należy napełnić komorę próbkową roztworem rozproszonych mikrosfer polistyrenowych o średnicy 800 nanometrów rozcieńczonym w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Pozostawić na 10 do 15 minut, a następnie delikatnie przepłukać buforem.

Aby usunąć nadmiar mikrosfer, należy zlokalizować mikrosferę przypadkowo przyklejoną do szkiełka nakrywki i regulować wysokość komory z próbką, aż mikrosfera znajdzie się około jednego mikrometra poniżej płaszczyzny ostrości. Aby wygenerować obraz nieostrość służący do pomiaru pozornej wielkości obrazu za pomocą programu LabVIEW, należy najpierw znaleźć środek mikrosfery, korzystając z funkcji dopasowywania wzorców geometrycznych. Następnie należy wygenerować radialny profil intensywności mikrosfery poprzez uśrednienie wartości w zakresie 360 stopni.

W okolicy centrum każdego przekroju dopasowano profil radialny, który odpowiada białemu pierścieniowi na każdym z obrazów w jasnym polu, przy użyciu funkcji kwadratowej. Aby wyznaczyć szczyt jasności, odległość między tym szczytem a centrum można wykorzystać jako miarę pozornej wielkości kuleczki. Używając skalibrowanego stolika piezoelektrycznego, stopniowo zwiększaj pozycję osiową mikrosfery i wykonuj obraz w każdej pozycji osiowej za pomocą kamery CCD. Powtórz analizę obrazu dla każdego kolejnego zdjęcia, aby skorelować pozorną wielkość mikrosfery z jej położeniem osiowym.

Rozdzielczość osiowa uzyskana tą metodą wynosi około 1,4 nanometra. Aby zmapować potencjał optyczny wiązki manipulacyjnej, należy rozpocząć od kolimacji i wyrównania wiązki manipulacyjnej z wiązką kalibracyjną przy wyłączonej wiązce manipulacyjnej. Następnie należy uwięzić wolną mikrosferę w znacznie sztywniejszej pułapce wiązki kalibracyjnej. Teraz należy włączyć wiązkę manipulacyjną.

Ponieważ jest on znacznie słabszy od wiązki kalibracyjnej, pozycja osiowa mikrosfery ulegnie niewielkiemu zaburzeniu. Wynikową zmianę pozycji osiowej można zmierzyć na podstawie obrazów w jasnym polu z defokusem, zgodnie z wcześniejszym opisem. Przesuń ostrzenie osiowe i powtórz czynność, a następnie nanieś przemieszczenie delta X w funkcji pozycji osiowej ogniska wiązki kalibracyjnej.

Pozycja osiowa odpowiadająca największemu przemieszczeniu mikrosfery wyznacza środek obszaru liniowego pułapki optycznej. W celu rozciągnięcia próbki DNA zamocuj komorę zawierającą cząsteczki DNA przytwierdzone do powierzchni, a następnie, obserwując obraz w jasnym polu, ustaw ostrość wiązki manipulacyjnej nieco powyżej nierozciągniętych mikrosfer za pomocą teleskopu, a następnie koryguj położenie stolika, aż do momentu uwięzienia jednej z mikrosfer. Wstępnie ustaw mikrosferę w centrum płaszczyzny XY pułapki optycznej, wygeneruj w programie LabVIEW serię fal prostokątnych i prześlij je do AOD, aby cyklicznie włączać i wyłączać wiązkę laserową.

Obserwuj mikrosferę podczas wielokrotnego włączania i wyłączania pułapki. Zwróć uwagę, czy laser indukuje jakiś preferowany kierunek ruchu mikrosfery podczas iteracyjnego dostrajania jej pozycji w kierunkach X i y. Dzięki sterowaniu stolikiem piezoelektrycznym ruchy chaotyczne mikrosfery powinny stać się izotropowe w płaszczyźnie XY, choć będą wyraźnie ograniczone w czasie działania lasera.

Następnie ustaw koralik w kierunku osi Z. Ponownie włączaj i wyłączaj wiązkę lasera impulsowo, tym razem jednocześnie mierząc przemieszczenie osiowe mikrosfer w czasie rzeczywistym.

Ustaw scenę w obrębie obszaru liniowego, który jest punktem, w którym przemieszczenie w osi Z jest największe podczas rozciągania rampy DNA, oraz ustaw intensywność lasera, wysyłając sygnał napięcia do A OD od 0 V do 0,5 V w krokach co 0,025 V. Nagraj 400 klatek przy 100 klatkach na sekundę i wyciągnij z nich średnią, aby uzyskać przemieszczenie osiowe. Na koniec wykreśl krzywe rozciągania siły i dopasuj je do zmodyfikowanego modelu łańcucha przypominającego robaka (worm-like chain model).

Przedstawiono tutaj krzywe rozciągania dla sekwencji NA 2D o długościach 1, 298 par zasad oraz 247 par zasad dla krótkich fragmentów DNA. Konwencjonalny model łańcucha przypominającego robaka (WLC) nie wyjaśnia w pełni zależności między siłą a rozciągnięciem, ponieważ w tych skalach długości należy uwzględnić efekty skończonego rozmiaru oraz rozciągnięcie przy zerowej sile wynikające z ograniczeń brzegowych. Pomiary rozciągania pod wpływem siły muszą zatem zostać dopasowane przy użyciu zmodyfikowanego modelu WLC, w którym parametrami dopasowania są efektywna długość persystencji oraz rozciągnięcie przy zerowej sile, opisane szczegółowo w materiałach uzupełniających.

Dla dużych długości konturowych D-S-D-N-A efektywna długość persystencji jest po prostu nominalną długością persystencji wynoszącą około 50 nanometrów, a rozciągnięcie przy zerowej sile można pominąć w zmodyfikowanych dopasowaniach modelu WLC. Efektywne długości persystencji wynoszą 35 nanometrów dla DNA o długości 298 par zasad oraz 25 nanometrów dla DNA o długości 247 par zasad po jego opracowaniu. Metoda ta utorowała drogę do szeregu nanomechanicznych pomiarów DNA oraz kompleksów DNA-białko, w tym do badania kinetyki tworzenia i rozpadu pętli DNA pośredniczonych przez białka regulacyjne.