Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ilościowy pomiar organizacji podjądrowej w komórkach drożdży oraz analiza wpływu mutacji lub zmian w warunkach hodowli na tę organizację. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek drożdży do fazy logarytmicznej w warunkach minimalizujących autofluorescencję. Następnie komórki są przenoszone do komory hodowlanej w celu obserwacji pod mikroskopem.

Następnie wykonuje się obrazy w celu pomiaru odległości między różnymi strukturami znakowanymi fluorescencyjnie w komórce. Otrzymane wyniki wykazują różnice w organizacji pozjądrowej, która zależy od zmiany warunków odżywczych podczas wzrostu kultury drożdży. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki dotyczące współzależności między organizacją subjądrową chromatyny a regulacją genów.

Przygotowanie ryb i drożdży rozpoczyna się od sporządzenia minimalnego medium edynburskiego (EMM) lub EMM z dodatkiem chlorku amonu w celu zredukowania autofluorescencji, zamiast stosowania autoklawowania. Do sterylizacji roztworu glukozy należy użyć filtra 0,2 µm, a następnie dodać go do mediów autoklawowanych. W probówkach o pojemności 30 ml należy zaszczepić 3 ml EMM komórkami ryb i drożdży.

Komórki świeżo wyhodowane na płytce agarowej w bogatym medium YEA należy przenieść do probówek, lekko je zakapslować i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 RPM i 30 °C. Przez dwa dni należy utrzymywać komórki w fazie logarytmicznej, wykonując odliczanie w komorze Bürkera każdego ranka i wieczora oraz rozcieńczając zawiesinę do odpowiedniego zagęszczenia. W dniu eksperymentu.

Komórki powinny znajdować się we wczesnej fazie logarytmicznej wzrostu w pożywce z ograniczoną ilością azotu. Należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym, aby zebrać komórki w jeden osad na dnie probówki wirówkowej 1,5 ml w wirówce typu Eppendorf, przy maksymalnej sile odśrodkowej 1,5 RCF, najpierw wirując probówkę przez dwie minuty, a następnie obracając ją o 180 stopni i wirując przez kolejne dwie minuty. Należy usunąć cały nadsącz z wyjątkiem 10 do 15 µL i resuspenderć komórki w pozostałej pożywce, a następnie dodać porcję lektyny stężeniem 1 mg/mL, wysterylizowanej przez filtr.

Nanieś 5 µL roztworu lektyny na róg szkiełka nakrywkowego, a następnie dodaj 5 µL hodowli do kropli lektyny. Aby stworzyć komorę wzrostową dla komórek bazalnych S pom, nanieś pipetą 5 µL podłoża EMM na czystą laminkę, a następnie odwróć szkiełko nakrywkowe z hodowlą pod kątem 70 stopni nad podłożem i opuść je pionowo na EMM, uszczelniając krawędzie smarem silikonowym. Odetnij szeroki koniec końcówki o pojemności 200 µL i przymocuj wąski koniec do strzykawki o pojemności 2 mL.

Napełnij strzykawkę około 1 ml smaru silikonowego. Nałóż cienką linię silikonu na krawędzie szkiełka nakrywkowego, delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby uszczelnić komorę wzrostową. Rozpocznij od użycia obrazowania w polu jasnym, aby zlokalizować komórki i wykonać wykop.

Uzyskaj ostry obraz do mikroskopii konfokalnej. Używamy skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM 700 z obiektywem olejowym Plan Apochromat 63× oraz ustawieniem średniej z 16 linii skanowania w płaszczyźnie. Ustaw jednostki obszaru na 1 do 1,1, aby uzyskać przekrój optyczny o grubości 0,8 µm.

Przeskanuj komórki za pomocą laserów wykrywających Alexa 4 88 oraz mCherry lub GFP. Wykonaj wystarczającą liczbę obrazów, aby przeprowadzić pomiary w 60 komórkach dla każdego odpływu. Przejdź do nowej komory wzrostowej z nowymi komórkami.

Po 60 minutach obrazowania otwórz obraz w programie Zeen Light Edition, aby zmierzyć odległość między sygnałami różnych fluoroforów w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Otwórz narzędzie pomiarowe i dostosuj intensywność światła oraz kontrast, aby zidentyfikować środek każdego sygnału fluorescencyjnego, na przykład ciała bieguna wrzeciona i błony jądrowej, a następnie zmierz odległość między nimi. Przenieś dane do arkusza notatnika.

Porównaj średnie lub mediany odległości subkomórkowych pomiędzy różnymi szczepami i wariantami traktowania, korzystając z oprogramowania statystycznego lub testów, takich jak test t-Studenta lub test sum rang preparationsa Mann-Whitneya. W tym przykładzie szczep PJ 1 18 5 był hodowany w EMM, a próbkę umieszczono w komorze wzrostowej w celu obrazowania. Następnie pobrano alikwot PJ 1 18 5.

Kulturę przeniesiono do pożywki EMMN i inkubowano przez 15 minut, po czym próbkę umieszczono w komorze wzrostu w celu obrazowania. Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierzono odległość między locus a ciałem bieguna wrzeciona oraz między locus a błoną jądrową. Jak pokazano tutaj, stwierdzono statystycznie istotną różnicę w odległości klastra genów oddalającego się od błony jądrowej w kierunku ciała bieguna wrzeciona w komórkach głodzonych azotem w porównaniu do komórek hodowanych w obecności azotu.

Dane dotyczące pomiaru odległości między GFP a SBP miały rozkład normalny, w związku z czym średnie odległości można było porównać za pomocą testu T. Stwierdzono istotną różnicę między tymi dwiema wartościami średnimi. Dane dotyczące pomiaru odległości między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, dlatego mediany odległości porównano za pomocą testu suma rang Manna-Whitneya.

Po zastosowaniu tej procedury odnotowano istotną różnicę między dwiema wartościami mediany. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące korelacji poziomu ekspresji genów ze zmianami w organizacji podjądrowej można przeprowadzić inne metody, takie jak real-time PCR.