Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Celem niniejszej demonstracji jest obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie w żywych komórkach w macierzy 3D. W pierwszej kolejności należy wytworzyć stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie. Następnie komórki te należy wysiać w kolagenową macierz 3D, a następnie zarejestrować obrazy time-lapse migrujących komórek przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

Ostatecznie wyniki rzucają światło na lokalizację i dynamikę białek w migrujących komórkach za pomocą obrazowania time-lapse i analizy FP, umożliwiając obserwację dynamiki i lokalizacji białek w 3D oraz w czasie rzeczywistym. Stanowi to jedną z dróg do udzielenia odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące migracji komórek. Na przykład: w jaki sposób kontakty adhezyjne są regulowane przez białka cytoplazmatyczne?

Oraz w jaki sposób kontakty te są zaburzane przez specyficzne inhibitory. W szalce P 35 hoduj komórki przy konfluencji od 80 do 90%, a następnie przeprowadź transfekcję komórek wybranym plazmidem z użyciem lipo 2000 zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie umieść komórki w inkubatorze.

Następnego dnia przenieś komórki do dwóch szalek Petri P one 50 i inkubuj przez noc. Uzupełnij medium, dodając 50 µg/mL G four 18. Kontynuuj hodowlę w warunkach selekcji antybiotykowej przez dwa tygodnie.

Zbadaj kulturę pod kątem obecności kolonii opornych na G four 18. Następnie, korzystając z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, zidentyfikuj i zaznacz kolonie wykazujące ekspresję GFP.

Przemyć komórki dwukrotnie PBS. Po drugim przemyciu pozostawić cienką warstwę płynu w obrębie każdej zaznaczonej kolonii, aby zapobiec ich wyschnięciu. Przetrzeć obszar jak najbliżej krawędzi za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego, a następnie nanieść pipetą 10 µL trypsyny na kolonię.

Powtórz szybko tę czynność dla każdej kolonii. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w celu odspojenia komórek. Zweryfikuj pod mikroskopem, czy komórki mają okrągły kształt.

Nanieś 10 µL trypsyny na każdą kolonię, a następnie pipetuj, aby całkowicie odseparować komórki od płytki. Następnie przenieś każdą kolonię komórek do pojedynczej studni 24-dołkowej płytki hodowlanej w celu namnożenia stabilnych kolonii. W kolejnym kroku oceń ekspresję białka w koloniach, stosując standardowy western blot oraz immunofluorescencję.

Namnożyć wybrane linie komórkowe, modyfikując powierzchnię szkła. Dno naczynia zapewnia optymalne wiązanie kolagenu. Nanieść pipetą 300 µL roztworu do sylilizacji na szklaną część każdego naczynia P 35 z otworem 10 mm.

Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór i przemyć wodą filtrowaną trzykrotnie przez 10 minut w każdym cyklu. Usunąć wodę i umieścić szalki na płycie grzejnej o temperaturze 50 °C na 1,5 godziny.

Ustaw pokrywki naczyń lekko przesunięte względem nich, aby umożliwić wysychanie. Po ostygnięciu wysuszonych naczyń pipetuj 300 µL 2% roztworu glutaraldehydu na szklaną część każdego naczynia. Inkubuj przez jedną godzinę, a następnie przemyj PBS 3 razy po 10 minut.

Następnie wysterylizuj szalki, naświetlając je światłem UV przez jedną godzinę. W pierwszej kolejności odwiruj 100 µL fluorescencyjnych cząsteczek znacznika w celu uzyskania osadu. Odlej ciecz i resuspenduj cząsteczki w 500 µL pożywki.

Przeprowadź pięć przemyć, a następnie resuspenduj cząsteczki w 30 µL pożywki. Następnie zbierz komórki wykazujące ekspresję GFP za pomocą trypsyny i przygotuj zawiesinę o stężeniu 2 milionów komórek na ml w probówce typu Eppendorf. Odmierz pipetą 240 µL pożywki wzrostowej. Dodaj 12,6 µL HEPES o stężeniu 1 M, 20 µL filtrowanej wody, 50 µL roztworu komórek oraz 10 µL cząsteczek fluorescencyjnych.

Na koniec należy dodać 167 µL kolagenu z skóry bydlęcej i dokładnie wymieszać roztwór. Następnie przenieść 80 µL na szklaną część przygotowanej szalki sylikonizowanej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut, aby żel uległ polimeryzacji.

Następnie ostrożnie dodaj 2 mL pożywki wzrostowej. Doprowadź komorę mikroskopu do stanu równowagi w stałej temperaturze 37 °C, uzupełniając pożywkę komórkową. Aby utrzymać neutralne pH podczas obrazowania DIC, wymień pokrywkę szalki na szklaną z cienkim paskiem parafiny.

Przykryj bok szalki, aby zapobiec odparowywaniu w przypadku użycia obiektywu imersyjnego. Nanieś jedną kroplę cieczy imersyjnej w miejscu styku z obiektywem. Umieść szalkę z żelem kolagenowym na stoliku mikroskopu w taki sposób, aby szalka miała kontakt z cieczą imersyjną.

Ustaw ostrość próbki i wyszukaj komórki przeznaczone do obrazowania, aby zminimalizować dryft stolika. Pozostaw naczynie na około 45 minut w celu stabilizacji. Przed rozpoczęciem długiego procesu rejestracji określ parametry akwizycji obrazu dla eksperymentów z dodatkiem inhibitora.

Przygotować pożywkę uzupełnioną lekiem o pożądanym stężeniu roboczym. Odnowić pożywkę komórkową w celu utrzymania neutralnego pH, ale nie zamykać jej za pomocą Perfilu. Przenieść próbkę pod mikroskop i przystąpić do obrazowania w momencie podania leku.

Zatrzymaj obraz, uchwyć i ostrożnie zdejmij pokrywkę naczynia, aby nie poruszyć jego zawartości. Odessij pożywkę i pipetuj pożywkę zawierającą lek do naczynia. Następnie ostrożnie załóż pokrywkę z powrotem.

Konfiguracja FRAP w górnej części urządzenia różni się w zależności od systemu. Należy zatem zapoznać się z instrukcją producenta. W pierwszej kolejności należy ustawić parametry obrazowania żywych komórek.

Do fotowybielania. Należy przetestować te parametry na komórkach próbnych, aby dobrać odpowiednią moc lasera, która pozwoli na fotowybielenie sygnału fluorescencyjnego bez uszkodzenia komórki. Następnie należy rozpocząć przechwytywanie obrazu próbki, rejestrując co najmniej pięć klatek.

Następnie przeprowadź fotowybielanie obszaru zainteresowania. Kontynuuj rejestrację obrazów w czasie powrotu fluorescencji. Za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej zmierz średnią intensywność fluorescencji w obszarze poddanym fotowybielaniu przed i po zabiegu w funkcji czasu.

Dopasuj krzywą regeneracji do równania wykładniczego. Wyznacz parametry czasu połowicznego oraz intensywności końcowej z dopasowanej krzywej wykładniczej. Następnie oblicz frakcję mobilną, wyznaczając stosunek końcowej do początkowej intensywności fluorescencji.

Te obrazy żywych komórek w 3D przedstawiają zdrowe komórki nabłonkowe wykazujące ekspresję GFP aktyny. Po czterech dniach hodowli komórki te utworzyły torbiel w trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Niektóre komórki migrowały wzdłuż powierzchni torbieli, podczas gdy inne migrowały wewnątrz niej.

Deformację macierzy wynikającą z sił trakcyjnych wywieranych przez migrujące komórki analizuje się poprzez przemieszczenie cząstek znacznika osadzonych w otaczającej macierzy. Przedstawiono tutaj wpływ inhibicji kinazy RO na siłę trakcyjną. Ruchy cząstek znacznika wyświetlane są jako obraz maksymalnej projekcji z różnych punktów czasowych, przy czym każdy punkt czasowy jest oznaczony pseudokolorem.

Alternatywnie obrazy pojedynczej cząsteczki znacznika są prezentowane w formie montażu, aby ukazać ruch tej cząsteczki. W czasie ta cząsteczka znacznika przemieszczała się w stronę i oddalała od krawędzi tylnej migrującej komórki odpowiednio przed i po dodaniu Y 2 7 6 3 2. Analiza FRAP śledzi komórki wykazujące ekspresję GFP actin podczas ich migracji w macierzy trójwymiarowej, co wskazuje na typowy powrót fluorescencji. Po eksperymencie fotowybielania przy zoptymalizowanych ustawieniach lasera intensywność fluorescencji w obszarze zainteresowania jest widocznie zmniejszona w porównaniu z poziomem tła, przy jednoczesnym zachowaniu zdrowia i nienaruszonej struktury komórek.

Wykres ten przedstawia dopasowanie krzywej regeneracji do funkcji wykładniczej. Po opanowaniu techniki, wysiew komórek w macierzy może zająć godzinę. Należy pamiętać, że praca z aminopropylotrimetylosilanem może być niezwykle niebezpieczna.

Należy zatem podjąć środki ostrożności, takie jak praca w dygestorium chemicznym. Pamiętaj również o zachowaniu warunków sterylnych podczas pracy z komórkami w matrycy 3D.