Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej
3 maja 2011
Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie nieinwazyjnej i beznacznika mikroskopii fotoakustycznej o rozdzielczości optycznej (Pam) mikrokrążenia in vivo. Jest to realizowane poprzez wprowadzenie zwierzęcia doświadczalnego w stan znieczulenia. Drugim krokiem procedury jest ustawienie obszaru zainteresowania poprzez przemieszczenie głowicy obrazującej mikroskopu fotoakustycznego o rozdzielczości optycznej; następnie ustawiane są parametry skanowania i rozpoczyna się akwizycję obrazu.
Ostatecznie rozkłady całkowitego stężenia tlenu oraz wysycenia hemoglobiny tlenem uzyskuje się poprzez obliczenia na podstawie eksperymentalnych danych wielodługościowych. Fotoakustyczna mikroskopia o rozdzielczości optycznej opiera się na wzbudzeniu laserowym i detekcji ultradźwiękowej. Krótki impuls wiązki laserowej jest ogniskowany w tkance biologicznej.
Absorpcja światła generuje przejściowe nagrzewanie i następującą po nim emisję ultradźwięków, która jest odbierana w celu stworzenia obrazu. Wyjątkową zaletą fotoakustycznej mikroskopii rozdzielczej (PAM) jest to, że umożliwia ona detekcję bezkontaktową oraz charakteryzuje się niezwykłą czułością na absorpcję optyczną. W przeciwieństwie do niej, istniejące technologie mikroskopii refleksyjnej i optycznej są przede wszystkim czułe na rozpraszanie optyczne lub fluorescencję. Zdolność do zapewniania bezetykietowego obrazowania absorpcji optycznej o wysokiej rozdzielczości in vivo sprawiła, że PAM znalazła szerokie zastosowania biomedyczne w neurologii, okulistyce, biologii naczyniowej i dermatologii.
Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej, czyli pamm, składa się z komponentów optycznych i ultradźwiękowych. Źródłem naświetlania optycznego jest laser barwnikowy pompowany impulsowym laserem stałym. Wyjściowa wiązka laserowa jest tłumiona przez filtr neutralnego zagęszczenia i sprzęgana z jednomodowym światłowodem w celu dostarczenia światła, co umożliwia skanowanie mechaniczne głowicy obrazującej mikroskopu zamiast żywego obiektu, aby efektywnie sprzęgać wielomodową wiązkę laserową do jednomodowego światłowodu.
W pierwszej kolejności wiązka przechodzi przez otwór o średnicy 50 µm. Otwór ten jest umieszczony nieco poza ogniskową soczewki kondensora, aby dopasować jego średnicę do średnicy wiązki w modzie podstawowym. W celu uzyskania ogniska optycznego o rozdzielczości bliskiej granicy dyfrakcyjnej, wyjście z włókna jednomodowego jest kolimowane i wypełnia tylną aperturę obiektywu mikroskopu.
Detekcja ultradźwiękowa odbywa się przy użyciu własnoręcznie wykonanego akustyczno-optycznego łącznika wiązek podłączonego do przetwornika ultradźwiękowego. Łącznik zapewnia współosiowe ustawienie naświetlania optycznego i detekcji akustycznej. W dolnej części łącznika wyszlifowano sferyczną wnękę, tworząc soczewkę akustyczną o aperturze numerycznej 0,5 w wodzie, co zapewnia akustyczną średnicę ogniska wynoszącą 43 µm przy częstotliwości centralnej 50 MHz.
W przypadku pierwszej kalibracji pomocne jest zastosowanie ultradźwiękowego pomiaru echa (pulse echo), aby określić położenie akustycznej płaszczyzny ogniskowania. Głowicę obrazującą reguluje się w pionie aż do uzyskania maksymalnego sygnału ultradźwiękowego echa. Aby zmaksymalizować czułość detekcji, należy zsynchronizować ogniska optyczne i akustyczne. Konfokalność.
Cel absorbujący optycznie, taki jak kawałek czarnej taśmy izolacyjnej, zostaje umieszczony w płaszczyźnie ogniskowej akustycznej. Następnie reguluje się pozycję ogniskową optyczną, aby zmaksymalizować sygnał fotoakustyczny. System PAM obejmuje również wzmacniacze elektroniczne i przetwornik analogowo-cyfrowy, skaner mechaniczny oraz sterownik skanera.
Zdigitalizowany sygnał jest przesyłany do komputera w celu utworzenia obrazu. Oprogramowanie przekształca surowe dane w sekwencję obrazów przekrojowych. W miarę jak głowica mikroskopu skanuje obiekt rastrowo, zarejestrowane obrazy mogą być następnie wyświetlane jako pojedyncze obrazy przekrojowe, dwuwymiarowe obrazy projekcji maksymalnej amplitudy lub renderingi 3D.
Zbiornik z wodą służy do umieszczenia głowicy obrazującej mikroskopu. W czarence Petriego wycięto okno obrazujące, które uszczelniono polietylenową membraną przezroczystą dla ultradźwięków i światła. Fala fotoakustyczna generowana przez obiekt jest sprzężona akustycznie z detektorem ultradźwiękowym najpierw za pomocą żelu ultradźwiękowego pomiędzy obiektem a membraną polietylenową, a następnie za pomocą wody dejonizowanej w czarence Petriego.
Te wynalazki i zastosowania dostępnych laserów optycznych oraz przetwornika ultradźwiękowego tworzą system PAM. W następnym segmencie wykonamy obrazowanie mikrokrążenia żywej myszy za pomocą tego systemu. Jeśli obrazowane zwierzę nie jest myszą nude, idealnie jest na 24 godziny przed eksperymentem przeprowadzić detekcję.
W ten sposób następuje ustąpienie podrażnienia naczyń skórnych. Mysz znieczulono 3% ISO w formie oparów w tlenie medycznym. Typowy przepływ wynosi od 1 do 1,5 litra na minutę.
W zależności od masy ciała zwierzęcia. Podtrzymuj znieczulenie przy użyciu 1% izofluranu. W trakcie całego eksperymentu wykonuj ucisk palca, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona. Przenieś mysz na stół stereotaktyczny z podkładką grzewczą, aby utrzymać temperaturę jej ciała na poziomie 37 °C.
Następnie rozpłaszcz ucho na plastikowej płytce. Potem nałóż na ucho warstwę żelu do badań ultrasonograficznych. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza w żelu.
Należy również zastosować maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu lub przypadkowemu uszkodzeniu laserem. Należy unikać bezpośredniego dotykania oka aplikatorem. Następnie umieść ucho pod oknem obrazującym i powoli podnoś stół dla zwierząt, aż żel ultradźwiękowy zetknie się z dolną częścią błony.
Wymagany jest delikatny kontakt, ponieważ dociśnięcie ucha do membrany może wpłynąć na przepływ krwi w uchu. Następnie należy zastosować kilka środków ostrożności w celu monitorowania stanu fizjologicznego zwierzęcia. Przymocuj pulsoksymetr do nogi lub ogona myszy.
Następnie obniż głowicę obrazującą, aż soczewka akustyczna zostanie zanurzona w wodzie dejonizowanej, i usuń pęcherzyki powietrza uwięzione pod soczewką akustyczną. Ustaw laser w trybie wyzwalania zewnętrznego i rozpocznij skanowanie próbne. Dostosuj pozycję Z głowicy obrazującej, aż optyczne i akustyczne podwójne ogniska znajdą się w środku ucha.
Następnie należy ustawić parametry skanowania i rozpocząć właściwą akwizycję obrazów. Aby zmierzyć całkowite stężenie hemoglobiny, ustaw długość fali na izosbestyczny punkt ISO, w którym oksyhemoglobina i deoksyhemoglobina mają równe molowe współczynniki wymywania.
Aby zmierzyć nasycenie hemoglobiny tlenem, należy ustawić drugą długość fali w punkcie, w którym współczynniki ekstynkcji molowej oksyhemoglobiny i deoksyhemoglobiny wykazują wyraźną różnicę. Po zakończeniu pomiaru należy oczyścić ucho myszy i umieścić zwierzę w inkubatorze. Przy ustawionej temperaturze otoczenia 37 °C, po przebudzeniu myszy, należy ją naturalnie przenieść z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt.
Ten obraz projekcji maksymalnej amplitudy przedstawia anatomię naczyniową ucha żywej myszy nagoj imaged za pomocą oPam przy 570 nanometrach. Ta projekcja obrazu pokazuje nasycenie hemoglobiny tlenem w tym samym uchu. Zostało ono obliczone na podstawie obrazów pozyskanych przy izosbestycznej długości fali 570 nanometrach oraz długości fali dominującej dla absorpcjitlenowej hemoglobiny 561 nanometrach.
Przy bliższym przyjrzeniu się zaznaczonemu obszarowi widoczna jest rozdzielczość oramm. Wyraźnie rozdzielono gęsto upakowane łożysko kapilarne. W tym filmie zaprezentowano typowy protokół eksperymentalny dla ORPM, obejmujący konfigurację systemu, ustawienie systemu, procedurę eksperymentalną in vivo oraz schemat obrazowania funkcjonalnego.
Jednym z najważniejszych aspektów konstrukcji i działania instrumentu jest konfokalne dopasowanie optyczno-akustyczne, które ma kluczowe znaczenie dla czułości obrazowania i rozdzielczości optycznej. Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej w połączeniu z głęboko penetrującą mikroskopią fotoakustyczną o rozdzielczości akustyczną oraz tomografią komputerową fotoakustyczną umożliwia obrazowanie funkcjonalne i molekularne in vivo w wielu skalach; przy użyciu tego samego kontrastu można obrazować obiekty od poziomu komórek i tkanek aż po całe organy. Taka skalowalność obrazowania ma potencjał zrewolucjonizować badania w biologii systemów wieloskalowych oraz badania translacyjne – od mikroskopowych odkryć laboratoryjnych po makroskopową praktykę kliniczną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół mikroskopii fotoakustycznej o rozdzielczości optycznej (OR-PAM), nieinwazyjnej techniki obrazowania zapewniającej rozdzielczość na poziomie komórkowym in vivo. Procedura obejmuje znieczulenie zwierzęcia, ustawienie głowicy obrazującej oraz pozyskiwanie obrazów w celu analizy mikrokrążenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Techniki obrazowania
- Mikroskopia fotoakustyczna
Wstęp
- OR-PAM to nowoczesna technologia obrazowania.
- Umożliwia ona obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej.
- Technika ta jest bezznacznikowa i nieinwazyjna.
- Pozwala ona na uzyskanie informacji o mikrokrążeniu i poziomach tlenu w tkankach.
Cel badania
- Aby zademonstrować zastosowanie OR-PAM in vivo.
- Aby dostarczyć wizualną instrukcję protokołów doświadczalnych.
- Aby zwiększyć zrozumienie dynamiki mikrokrążenia.
Zastosowane metody
- Znieczulenie zwierzęcia doświadczalnego.
- Ustawienie obszaru zainteresowania do obrazowania.
- Konfiguracja parametrów skanowania dla akwizycji obrazu.
- Obliczanie całkowitego stężenia i saturacji tlenu na podstawie danych wielodługościowych.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie mikrokrążenia in vivo.
- Pozyskanie danych dotyczących stężenia i nasycenia tlenem.
- Wykazanie nieinwazyjnego charakteru techniki.
- Walidacja OR-PAM jako narzędzia do obrazowania funkcjonalnego.
Wnioski
- OR-PAM jest skuteczną metodą obrazowania mikrokrażenia.
- Technika ta dostarcza cennych informacji na temat natlenienia tkanek.
- Posiada potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach badań biomedycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) umożliwia nieinwazyjne, beznak znacznikowe obrazowanie absorpcji optycznej tkanek z wysoką rozdzielczością, dostarczając funkcjonalnych i fizjologicznych informacji na poziomie mikro naczyniowym. Możliwość ta wypełnia krytyczną lukę w obrazowaniu na etapie odkrywania poprzez ilościowe określanie natlenienia oraz dynamiki hemoglobiny in vivo, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka i ciągłość translacyjną. Integracja detekcji optycznej i akustycznej w OR-PAM oferuje unikalną wartość w zakresie walidacji celów oraz pewności prognostycznej w przedklinicznych procesach badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację utlenowania tkanek i nasycenia hemoglobiny w celu badania funkcjonalnego celu terapeutycznego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe określanie odpowiedzi fizjologicznych w nienaruszonej mikrokrążeniu.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel dzięki ilościowym, beznacznikowym wynikom obrazowania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele in vivo do późniejszego przesiewu związków i badań mechanistycznych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary funkcji mikronaczyniowej i natlenienia.
- Umożliwia standaryzację testów i skalowalność platformy dla procesów obrazowania wysokotreściowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki obrazowania z istotnymi dla choroby biomarkerami fizjologicznymi, takimi jak saturacja tlenowa.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki wsparciu dla wielkoskalowego obrazowania funkcjonalnego.
- Minimalizuje ryzyko decyzji o dalszym rozwoju poprzez umożliwienie bezpośredniego pomiaru farmakodynamiki na poziomie tkankowym.
Integracja potoków i przepływów pracy
OR-PAM wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z translacyjną walidacją biomarkerów za pomocą ilościowego obrazowania in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez pomiar fizjologicznych zmian w mikrokrążeniu w czasie rzeczywistym.
- Przesiewy: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne obrazowanie parametrów naczyniowych i natlenienia w celu oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty stężenia hemoglobiny i nasycenia tlenem dla wiarygodnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Łączy dane z obrazowania funkcjonalnego ze strategiami biomarkerów przedklinicznymi w przypadku dostosowania do modeli chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do wielkoskalowych i wieloorganowych badań funkcjonalnych w programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy obrazowania dla badań in vivo.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie praktycznych danych fizjologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów w oparciu o dowody z obrazowania funkcjonalnego.
Uwagi dotyczące wdrażania
- Wymaga doświadczenia w wyrównywaniu układów optycznych i akustycznych oraz w protokołach obrazowania in vivo.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury laserowej, ultradźwiękowej oraz systemów akwizycji danych.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja parametrów obrazowania i przepływów pracy analizy danych.
- Może wymagać adaptacji do różnych typów tkanek lub modeli zwierzęcych w zależności od ich właściwości optycznych.
- Czułość i rozdzielczość obrazowania zależą od precyzyjnego wyrównania konfokalnego układu optyczno-akustycznego.
