Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Protokół mass squirm ma na celu ilościowe określenie aktywności demetylazy lizyny z wykorzystaniem metylacji izotopowej i spektrometrii mas MALDI. W pierwszej kolejności przeprowadza się reakcje demetylacji katalizowane enzymatycznie na peptydach zawierających metylowaną lizynę. Następnie produkty reakcji demetylazy poddaje się chemicznej metylacji przy użyciu deuterowanego formaldehydu, aby uzyskać jednorodnie zmetylowane peptydy jonizujące się w identyczny sposób w MALDI. Kolejnym krokiem jest ilościowe oznaczenie każdego gatunku peptydów za pomocą spektrometrii mas MALDI i uwzględnienie nakładania się izotopów. Aby zidentyfikować względne ilości peptydów niezmetylowanych, monometylowanych, dimetylowanych i trimetylowanych, wyniki analizy mass squirm pozwalają określić względne ilości każdego produktu reakcji demetylazy na podstawie zmian masy.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rutynowa spektrometria mas, jest to, że wynik masy uwzględnia różnice w jonizacji pomiędzy peptydami o różnym stopniu metylowania. Pomysł na to podejście pojawił się podczas opracowywania metody pomiaru poziomów acetylacji histonów przy użyciu izotopowo ciężkiego bezwodnika octowego. Wyzwaniem w tej technice jest pozyskanie danych o powierzchni piku, co może być utrudnione przez nakładanie się izotopowych obwiedni peptydów.

Do reakcji demetylacji połączono 125 ng rekombinowanego enzymu lizynowo-specyficznej demetylazy 1 z 0,25 µg biotynilowanego peptydu dimetylowego histonu H3 w końcowej objętości 20 µL buforu do demetylazy. Przygotowano również próbkę kontrolną zawierającą 0,25 µg peptydu bez enzymu LSD1. Protki z reakcją i kontrolą inkubowano przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Następnie, aby przygotować kulki R2 o porach 20 µm, zmieszano równe objętości kulek i metanolu.

Następnie dodaj 10 objętości TFA i kwasu mrówkowego, dodaj osiem mikrolitrów kulek porowatych do każdej próbki i mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie przygotuj dwie końcówki C 18 zip tips. Pipetuj dwukrotnie 20 mikrolitrów 0,1% TFA, następnie cztery razy 70% acetonitrylu z 0,1% TFA i ponownie cztery razy 0,1% TFA.

Następnie nanieś dwie próbki na przygotowane zip tipy. Za pomocą pipety przepchnij objętość cieczy przez żywicę C 18. Powtarzaj czynność, aż cała objętość obu próbek zostanie przepchnięta przez zip tipy.

Następnie przemyj końcówki zip tip dwukrotnie 20 µL 0,1% TFA, a następnie eluuj próbki do 40 µL buforu elucyjnego i całkowicie osusz je za pomocą koncentratora SpeedVac. W pierwszej kolejności resuspenduj próbkę w 100 µL 50 mM buforu fosforanowego o pH 7,4. Następnie dodaj 8 µL borodymetyloaminy oraz 16 µL odcieńczonego formaldehydu.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Powtórzyć redukcyjne metylowanie, dodając boronową dimetyloaminę oraz deuterowaną formaldehyd i inkubować przez dwie godziny. Za trzecim razem dodać boronową dimetyloaminę i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 godzin.

Przerwać reakcję, dodając 12,5 µL Tris o stężeniu 1 M (pH 7,4), a następnie całkowicie osuszyć próbki za pomocą koncentratora próżniowego (speed vac). Następnie resuspendować próbki kontrolne oraz próbki z reakcją demetylazy w 100 µL buforu fosforanowego o stężeniu 50 mM (pH 7,4).

Następnie należy dodać 8 µL porowatych kulek do próbek kontrolnych oraz próbek z reakcją demetylazy, a następnie zebrać je na końcówkach typu zip tip, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Eluuj w objętościach 2 µL na płytkę do MALDI i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej aż do krystalizacji. Przejdź do analizy próbek za pomocą spektrometrii mas.

Otwórz pliki spektroskopowe w oprogramowaniu roboczym i wyeksportuj je do oprogramowania M over Z. Następnie zweryfikuj produkty reakcji za pomocą tandemowej spektrometrii mas. W pierwszej kolejności określ stosunek powierzchni piku izotopów węgla 13 C dwa i węgla 13 C cztery w stosunku do piku monoizotopowego dla próbki kontrolnej.

Wykorzystaj obliczone stosunki do określenia względnej ilości peptydów w każdej z modyfikacji. Stan próbki po reakcji z demethylazą. Enzym LSD może być skutecznie wykorzystywany do ilościowego oznaczenia demetylacji lizyny w skali masowej.

Ponieważ reakcja kontrolna nie ulega metylowaniu redukcyjnemu, wskazuje ona typową obwiednię izotopową dla tego peptydu. Wynikowe powierzchnie pików określają stosunki tła peptydu występującego w formie carbon 13 C two oraz carbon 13 C four. Stany izotopowe oraz powierzchnie pików z widma masowego dla reakcji kontrolnej umożliwiają ilościowe określenie względnej zawartości peptydu w każdym stanie modyfikacji. W reakcji demetylazy powierzchnie pików z tych reakcji kontrolnych i demetylujących wykazują 33,7% dimethyl lysine 4, 42,0,3% monomethyl lysine four oraz 24% unmethylated lysine four.

To podejście oparte na masowej spektrometrii dostarcza kluczowych informacji w dziedzinie epigenetyki histonów, takich jak wpływ demetylacji reszt lizyny histonów na rozwój różnych chorób. Chociaż ten test metylacji był stosowany do badania demetylaz, można go również wykorzystać do badania metylotransferaz.