Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar funkcji populacji kanałów CFTR w odtworzonym systemie i zbadanie odpowiedzi kanałów na obecność cząsteczek modulatora. Osiąga się to poprzez uprzednie oczyszczenie dzikiego lub zmutowanego białka CFTR z dziewięciu komórek SF przy użyciu procedury szybkiego oczyszczania, która daje funkcjonalne białko CFTR w roztworze detergentu. Drugim krokiem jest rozpuszczenie oczyszczonego białka w liposomach protei zdefiniowanego lipidu wybranego przez eksperymentatora.

Następnie w poprzek błony rozwija się gradient chemiczny jodku poprzez usunięcie dodatkowego jodku liposomalnego w celu wytworzenia siły napędowej do ruchu jonów przez kanał CFTR. Ostatnim krokiem jest aktywacja kanału i zainicjowanie uwalniania jodku z liposomów protei w obecności interesującej cząsteczki modulatora. Ostatecznie, elektroda selektywna jodku jest używana do monitorowania funkcji kanału CFTR w czasie rzeczywistym w tym odtworzonym systemie.

Metoda ta umożliwia badanie aktywności kanału chlorkowego oczyszczonej populacji cząsteczek CFTR po rekonstytucji do liposomów fosfolipidowych. Chociaż metoda ta została zdecydowana, aby zapewnić wgląd w funkcję dziewięciokanałowego C-F-D-R-N i wpływ modulatorów małocząsteczkowych, metoda ta może być również stosowana w innych systemach, takich jak charakterystyka funkcjonalna innych białek błonowych. Aby odnieść sukces, osoby nowe w tej metodzie muszą upewnić się, że zoptymalizowały proporcje białka do lipidów dla swojego systemu, że nie pracują ze słabo funkcjonalnym lub niefunkcjonalnym białkiem i że wygenerowały wystarczający gradient jodku w dobrze uszczelnionych pęcherzykach.

Aby przygotować lipid, najpierw wysusz pięć miligramów fosfatydylocholiny jaj lub PC jaja w probówce ze szkła krzemianowego innego niż boro pod strumieniem argonu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie oblicz potrzebną objętość buforu szóstego, jak wskazano w protokole tekstowym, a następnie dodaj bufor szósty bezpośrednio do lipidu. Uszczelnij szklaną probówkę perfilem, a następnie wiruj probówkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zawiesić lipid w buforze.

Następnie zawiesić lipid w temperaturze pokojowej za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do jednomililitrowej strzykawki, aż nie będzie widocznego filmu lipidowego z boku probówki. Bufor będzie mętny z powodu zawieszonego lipidu. Sonikować lipid w probówce przez 22 impulsy w kąpieli, sonikować zawierającym lód, a następnie umieścić probówkę na lodzie, aby odpoczęła na jedną minutę.

Wykonaj ten cykl trzy razy. Następnie dodaj białko CFTR do lipidu, uzyskując końcową objętość jednego mililitra. Wymieszaj białko z zawiesiną lipidową 10 razy za pomocą igły o rozmiarze 25.

Umieścić próbkę na lodzie na 30 minut, obracając probówkę pięć razy co pięć minut, aby wymieszać podczas inkubacji próbki. Złamać dolną klapkę jednorazowej kolumny wirowej wiążącej detergent i odwirować kolumnę przez dwie minuty 2000 razy G.To usunąć bufor magazynujący, umyć kolumnę pięcioma mililitrami buforu siedem i odwirować kolumnę przez cztery minuty 2000 razy. G, aby wymyć bufor myjący.

Przemyć kolumnę trzy razy, przenieść całą jednomililitrową próbkę lipidów białkowych na wierzch żywicy kolumny, a następnie inkubować kolumnę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Odwirować kolumnę w temperaturze pokojowej przez cztery minuty w temperaturze 2000 razy G. Następnie przenieś mętną próbkę liposomu protei do czystej rurki z mikrobezpiecznikiem i umieść probówkę na lodzie. Namocz pięć gramów kulek cidex G 50 w 50 mililitrach buforu dziewiątego przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie załaduj cztery małe kolumny przesiewające nasyconymi kulkami, aż będą wypełnione co najmniej w trzech czwartych. Odwirować kolumny przez cztery minuty w temperaturze 2000 razy G, aby usunąć nadmiar buforu z żywicy. Około 2,25 mililitra wypełnionej żywicy powinno znajdować się w kolumnie po odwirowaniu.

Bardzo ważne jest, aby żywica była odpowiednio uwodniona do elucji za pomocą liposomów protea. Następnie przenieś 125 mikrolitrów próbki liposomu protei na górę każdej kolumny i odwiruj przez cztery minuty po 2000 razy. G Zebrać EIT do wykorzystania w eksperymentach FLX z jodkiem.

Umieść małą mieszadło z włókniny F w jednym dołku na płytce 96-dołkowej, a następnie dodaj 150 mikrolitrów VX seven 70 o stężeniu 20 mikromolowym w buforze dziewiątym do studzienki. Użyj końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie dodaj 150 mikrolitrów próbki liposomu protei do studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość 300 mikrolitrów.

Umieść 96-dołkową płytkę na płytce mieszającej z prędkością 130 obrotów na minutę. Włóż końcówkę elektrody wrażliwej na jodek do roztworu, nie dotykając mieszadła ani dna studzienki. Aby zarejestrować ślady sygnału elektrody, należy przefiltrować sygnał przez filtr dolnoprzepustowy z częstotliwością próbkowania wynoszącą dwa hercowe zapisy z próbki przez pięć minut, aby umożliwić zrównoważenie próbki.

Powinien on wytworzyć stabilną, prawie płaską linię bazową. Następnie dodać trzy mikrolitry 100-milimolowego roztworu podstawowego magnezu A TP o pH siódmym. Aby aktywować kanały CFTR, pozwól próbce zrównoważyć się przez kolejne pięć minut, aby osiągnąć nową linię podstawową.

Następnie dodaj trzy mikrolitry dwumikromolowego roztworu podstawowego. Mycyna valin w celu wyeliminowania gradientu elektrochemicznego generowanego przez aktywność CFTR. Rejestruj spadek napięcia spowodowany aktywnością jodku FLX za pośrednictwem CFTR przez co najmniej pięć minut.

Następnie dodaj trzy mikrolitry roztworu 10% Triton X 100 do próbki, aby uwolnić jodek ze światła liposomu protei jako kontrolę. Znaczne uwalnianie jodku wskazuje, że jodek uwięziony w pęcherzykach nie ograniczał aktywności CFTR. Po zmierzeniu próbki należy wykonać serię rozcieńczeń jodku potasu od stężeń mikromolowych do nanomolowych w buforze dziewiątym.

Zaczynając od najbardziej rozcieńczonego roztworu, zapisz reakcję elektrody w miliwoltach przy każdym stężeniu jodku, aby wygenerować krzywą wzorcową. CFTR typu dzikiego oznaczono na obecność jodku. Aktywność strumienia F mierzona w molach ano na sekundę po rozpuszczeniu.

Strumień jodku F jest znacznie stymulowany w obecności CFTR i A TP w porównaniu z kontrolą pozbawioną CFTR i przez dodanie TP. Gdy CFTR jest fosforylowany przez cykliczną kinazę białkową zależną od A MP. Podjednostka katalityczna znana jako PKA, odwrotnie, wstępne traktowanie silnym inhibitorem CFTR inhibitorem 1 72 zmniejsza szybkość FLX jodku, zdolność VX seven 70 do nasilania strumienia jodku F typu dzikiego CFTR była testowana bez i z fosforylacją przez PKA VX 70 zwiększała względny jodek FLX tylko w obecności fosforylowanego CFTR. Skuteczny test VX seven 70 przeprowadzono przy użyciu wariantu CFTR o nazwie Delta 5 0 8 CFTR i nieaktywnego analogu V 0 9 11 88 nie nasila aktywności fosforylowanej delta 5 0 8 CFTR, podczas gdy VX seven 70 zwiększa względny jodek flx Po opanowaniu technikę tę można wykonać od oczyszczania poprzez pomiary aktywności CFTR w typowym ośmiogodzinnym dniu pracy, oczyszczanie CFTR trwa około czterech godzin, a rekonstytucja trwa kolejną godzinę przed rozpoczęciem testu eFlex.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, w tym test T PS i pojedynczy kanał, przeprowadzają pomiar w para lipidie S, można wykonać przy użyciu tego samego preparatu białka CFDR, aby dokładniej scharakteryzować interakcję z małymi cząsteczkami. Korzystając z tych metod, badacz mukowiscydozy będzie w stanie odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie modulatora CFTR, a mianowicie, czy modulator ten oddziałuje bezpośrednio z białkiem CFTR, a także jaki jest mechanizm działania tego modulatora.