Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

W niniejszej procedurze przedstawiamy ilościową metodę mikroskopii przyżyciowej służącą do oceny dynamiki przechodzenia pasożytów przez śledzionę. W modelu malarii u gryzoni myszy zainfekowane transgenicznymi pasożytami GFP są przygotowywane do mikroskopii przyżyciowej śledziony; kaniulacja żyły śledzionowej umożliwi wstrzyknięcie barwników przyżyciowych. W trakcie eksperymentu obrazowane są fluorescencyjne komórki przemieszczające się w różnych obszarach śledziony.

Przedstawiamy metodologię opisu mobilności pasożytów w trójwymiarowym wolnym przedziale miazgi czerwonej oraz obliczania przepływu krwi w naczyniach. Parametry te zostały wykorzystane do porównania dynamiki śledziony u dwóch szczepów PULE. Dzień dobry wszystkim.

Nazywam się Nando El Portillo, a jednym z głównych pytań badawczych w moim laboratorium jest próba zrozumienia roli śledziony w malarii. Splenomegalia jest jednym z charakterystycznych objawów tej choroby, jednak ze względu na kwestie techniczne i etyczne prowadzenie badań nad tym organem jest bardzo trudne. Aby temu zaradzić, wykorzystaliśmy technologie, które pozwalają nam obserwować dynamiczne przemieszczanie się tego pasożyta i ilościowo oceniać to zjawisko.

To właśnie wyjaśnią Lorena i MI w poniższych protokołach. Badania te są prowadzone częściowo we współpracy z grupami dr. Ler z Uniwersytetu w Hamburgu w Niemczech oraz dr Marii Kbo tutaj, w szpitalu Clinic, i otrzymały ogólne finansowanie z funduszy Cellex oraz ministerialnego CIA In Espanol. Infekcję rozpoczyna się od Dawcy M zakażonego letalnymi lub nieletalnymi pasożytami GFP przy poziomie 10% pasożytów. Aby sprawdzić obecność pasożytów, należy pobrać małą kroplę krwi z żyły ogonowej myszy i rozmazać ją na szkiełku mikroskopowym.

Przygotuj preparat do barwienia kolorymetrycznego z użyciem GIMs. Roztwór ten umożliwi wizualizację zakażonych erytrocytów po wyschnięciu; utrwal rozmaz krwi w metanolu przez dwie minuty, nałóż roztwór GIMs i inkubuj przez 20 minut. Przemyj szkiełko bieżącą wodą z kranu i wysusz, a następnie określ procentowy udział zakażonych erytrocytów w stosunku do całkowitej liczby erytrocytów, korzystając z mikroskopu świetlnego z obiektywem imersyjnym 100x.

Zainfekuj myszy letalnymi lub nieletalnymi pasożytami otrzymanymi z krwi ogonowej myszy dawców i rozcieńczonymi w PBS. Dostosuj dawkę tak, aby wstrzyknąć pół miliona pasożytów na mysz w celu osiągnięcia poziomu pasożytnictwa obwodowego wynoszącego 1% w trzeciej dobie po infekcji; podaj preparat do jam brzusznych. Alternatywnie, w grupie kontrolnej można zastosować RBC znakowane FITC.

Od zwierząt pobiera się jeden mililitr krwi tętniczej z myszy, a następnie pellet płucze poprzez wirowanie w PBS zawierającym EDTA, resuspendsuje w roztworze FITC i inkubuje przez dwie godziny w ciemności przy delikatnym mieszaniu. Po tym czasie nadłącznie usuwa się przez wirowanie i przeprowadza dokładne płukanie. Preparat wstrzykuje się myszy kontrolnej do uzyskania średniego stężenia 1% w krążeniu obwodowym, a następnie przystępuje się do eksperymentów in vivo.

Witajcie, nazywam się mija. Aby obrazować śledzionę in vivo, musimy przeprowadzić niewielką operację chirurgiczną zwierzęcia w celu odsłonięcia śledziony; tę technikę opanowałam pod kierunkiem Stephanie GR w laboratorium Heislera, której chciałabym podziękować. Teraz pokażę Państwu, jak postępować.

Obrazowanie zakażonego mięśnia przeprowadzono w trzeciej dobie po zakażeniu, gdy poziom paratu wynosił 1% w obu szczepach. Przez cały czas trwania procedury mysz należy utrzymywać w znieczuleniu i w kontrolowanej temperaturze. Należy chronić oczy przed odwodnieniem i przed przystąpieniem do dalszych czynności zweryfikować, czy mysz jest całkowicie znieczulona, poprzez uciśnięcie poduszeczki stopy, aby ułatwić dożylną administrację substancji.

W trakcie eksperymentu przeprowadź kaniulację ogonowej żyły myszy w celu założenia kaniuli. W jednym końcu rurki umieść małą igłę, a w drugim aplikator. Napełnij kaniulę solą fizjologiczną, usuwając pęcherzyki powietrza, i sprawdź, czy roztwór przepływa przez kaniulę prawidłowo.

Kaniulacja żyły bocznej ogona zostanie przeprowadzona w warunkach sterylnych. W celu zwiększenia widoczności żyły należy zastosować delikatną konstrikcję u nasady ogona. Następnie należy wprowadzić końcówkę kaniuli do wnętrza żyły.

Pojawienie się krwi będzie wskazywać, że igła jest prawidłowo umiejscowiona. Jeśli tak nie jest, należy powtórzyć kanulację powyżej miejsca wkłucia w żyłę, a następnie przymocować kaniulę do ogona za pomocą kleju i taśmy. Odsłoń dolną część śledziony poprzez niewielkie nacięcie skóry i mięśni po lewej stronie grzbietowej zwierzęcia.

Umieść śledzionkę w miejscu, w którym obserwuje się mniejszy ruch oddechowy, i nanieś PBS na powierzchnię zewnętrzną, aby zapewnić nawilżenie oraz oczyścić ją z włosów myszy. Przykryj śledzionkę osłonką, aby umożliwić wizualizację. Witaj, nazywam się Lorena.

Przedstawiony protokół pozwoli na wizualizację przemieszczania się pasożytów PULI przez śledzionę. Stało się to możliwe dzięki zastosowaniu transgenicznych pasożytów GFP. Materiał udostępniony przez Jamesa Burnesa z Drexel University.

Obrazowanie ruchu fluorescencyjnych pasożytów pozwoli nam ustalić, czy istnieją różnice w zachowaniu między szczepami letalnymi a nieletalnymi. Eksperymenty z mikroskopii żywych organizmów przeprowadzono przy użyciu mikroskopu wielofotonowego Leica, wyposażonego w system inkubacji z kontrolą temperatury oraz obiektyw glicerynowy 63 x. Umieść zwierzę na stoliku mikroskopu z pokrywką szkłem, tak aby śledziona była skierowana w dół, w stronę obiektywu. Początkowo.

Wizualizacja śledziony przy mniejszych powiększeniach zapewni ogólny wgląd w strukturę mikrokrażową tego narządu. Po ustawieniu ostrości na śledzionie przy użyciu autofluorescencji tkanki, obserwuje się pasożyty GFP przechodzące przez różne obszary śledziony. Dzień dobry, nazywam się Maria Albo z Centrów Naukowo-Technologicznych Uniwersytetu w Barcelonie i przeprowadzimy obrazowanie intravitalne śledziony.

W celu zbadania przepływu krwi oraz mobilności zainfekowanych erytrocytów wykorzystamy mikroskop konfokalny wyposażony w skaner rezonansowy, który umożliwia obrazowanie z wysoką prędkością, co jest niezwykle przydatne w celu uniknięcia artefaktów ruchowych narządu. Jest to mikroskop spektralny, który pozwala na wybór zakresu widzenia. Aby uzyskać bardzo szybki obraz, przeprowadzimy jednoczesną akwizycję dwóch znakowań fluoresceiną oraz odbicia.

Wybierz różne obszary do obrazowania przy użyciu RBC, barwników refleksyjnych, kontrastowych oraz barwników Vidala, aby uwidocznić mikrokrążenie śledziony. Teraz wyjaśnimy, jak mierzyć mobilność pasożytów w przepływie krwi w naczyniach, wykorzystując mikroskopię Vidala oraz oprogramowanie ImageJ do śledzenia ruchu pasożytów w trójwymiarowej sieci miazgi czerwonej. Pozyskaj obrazy dla pięciu płaszczyzn Z, korzystając z trybu szybkiego skanowania.

Przekształć stosy obrazów w filmy kolorowe z kodowaniem osi Z, aby ułatwić śledzenie pojedynczych komórek fluorescencyjnych. Szczegółowe informacje zawarto w tekście; śledź różne cząsteczki w czasie i w głębi każdego filmu, korzystając z współrzędnych X, Y, Z oraz T. Parametry mobilności, takie jak kierunkowość, średnia prędkość i czas przebywania, mogą zostać obliczone i przedstawione w formie map rozkładu, co umożliwia analizę porównawczą między populacjami szczepów. Przepływ naczyniowy w śledzionie można obrazować poprzez systemową iniekcję kilku cząsteczek fluorescencyjnych, takich jak dekstryna, opisanych w tabeli pomocniczej.

Następnie, wykorzystując endogenny kontrast refleksyjny erytrocytów, należy przeprowadzić skanowanie przepływu krwi wzdłuż linii środkowej, ustawiając naczynia poziomo w kierunku skanowania laserowego i stosując ulepszone uśrednianie liniowe (Line average). Na obrazach tych smugi powstające w wyniku ruchu komórek zostaną wykorzystane do obliczenia przepływu krwi; należy wykonać obrazy naczyń o różnych średnicach oraz w różnych fazach cyklu serca, aby skompensować fluktuacje. Śledziona od dawna była uważana za „czarną skrzynkę” w badaniach nad malarią, dlatego opracowaliśmy ilościową metodę mikroskopii intravitalnej, aby uzyskać wgląd w dynamikę infekcji pasożytniczej i przepływu krwi w tym narządzie, co pozwoliło nam odpowiedzieć na istotne pytania biologiczne, takie jak przyleganie zainfekowanych czerwonych krwinek do śledziony in vivo.

Dziękujemy i.