Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie kompozytowej macierzy wykonanej z naturalnych biomateriałów, która może być wykorzystana do dostarczania i różnicowania komórek macierzystych w celu wspomagania gojenia ran. Osiąga się to poprzez wstępną izolację mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej (ASC) z organizmu zwierzęcia testowego. Następnie ASC są załadowywane na wcześniej przygotowane mikrosfery chitozanowe.

Następnie odlewa się żel z kolagenu włóknistego, a na jego powierzchni rozmieszcza się kuleczki A-S-C-C-S-M. Na koniec na żel kolagenowy z A-S-C-C-S-M odlewa się żel z fibryny PEG i dodaje pożywkę. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące dwukierunkową, symultaniczną migrację A SC z kuleczki CSM do macierzy kolagenowej oraz macierzy fibryny PEG.

Dzięki tej procedurze pojedyncze źródło komórek macierzystych może odbierać zróżnicowane sygnały z mikrośrodowisk kolagenowych i PEG-fibrynowych, co prowadzi do ich zróżnicowanej stymulacji do produkcji czynników plejotropowych i tworzenia sieci przednaczyniowych struktur. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kompozyty z pojedynczego materiału czy odkomórkowane zamienniki skóry, jest fakt, że pozostałe produkty nie oddziałują aktywnie na rewakularyzację produktu przez organizm gospodarza. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że izolowane RAD A SE wykazują tendencję do różnicowania się w kierunku fenotypu naczyniowego podczas hodowli w macierzy fibrynowej pochodzenia wieprzowego.

Obserwacja ta zapoczątkowała koncepcję, zgodnie z którą pojedyncze źródło komórek macierzystych mogłoby być wykorzystane jednocześnie w układzie składającym się z różnych biomateriałów. Po wyizolowaniu i wyhodowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASCs), przygotowaniu mikrosfer chitozanowych (CSMs) i załadowaniu ASCs do CSMs, należy przygotować hydrożel z glikolu polietylenowego i fibryny poprzez rozpuszczenie zmodyfikowanego kwasem bursztynowym PEG w czterech mililitrach soli buforowej Tris. Bezpośrednio przed eksperymentem roztwór należy wysterylizować za pomocą filtra 0,22 µm.

W dołku płytki sześciodołkowej wymieszać 500 µL roztworu zapasowego fibrynogenu i 250 µL roztworu zapasowego PEG, a następnie inkubować przez 20 minut w inkubatorze z wilgotną atmosferą w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Następnie 250 µL wcześniej przygotowanego A-S-C-C-S-M wymieszać z roztworem pegylowanego fibrynogenu, bezzwłocznie dodać 1 mL roztworu zapasowego trombiny i za pomocą pipety szybko trzykrotnie wymieszać; natychmiast przelać mieszaninę komórkowo-żelową do płytki 12-dołkowej i inkubować w komorze z wilgotną atmosferą w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Następnie otrzymany peg-fibrynę dwukrotnie przemyć HBSS i inkubować w medium alpha-MEM uzupełnionym o 10% FBS w inkubatorze z wilgotną atmosferą w 5% CO2 w temperaturze 37 °C, stosując standardowe techniki mikroskopii świetlnej przez okres 11 dni.

Obserwuj migrację komórek z CSM do mieszaniny żelowej A-S-C-C-S-M z kolagenem typu I wyekstrahowanym z ścięgien ogona szczura przy użyciu dwóch normalnych wodorotlenku sodu. Dostosuj pH do 6,8 i przeprowadź fibrylację. Dodaj fibrylowany kolagen i mieszaninę A-S-C-C-S-M do płytki 12-dołkowej i inkubuj w inkubatorze z nawilżaniem i 5% carbon dioxide w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Po upewnieniu się, że fibrylacja została zakończona, inkubować żele kolagenowe A-S-C-C-S-M przez maksymalnie 11 dni w inkubatorze z nawilżaniem i 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37°C. Obserwować migrację komórek z CSM do wnętrza żelu w okresie 11 dni, stosując standardowe techniki mikroskopowe, aby wytworzyć konstrukcję dwuwarstwową w celu zbadania właściwości migracyjnych i koindukcyjnych pojedynczego źródła komórek macierzystych, wykorzystując dwa rusztowania biologiczne.

Przygotować żele kolagenowe oraz żele fibrynowe z PEG z następującymi niewielkimi modyfikacjami: przygotować jeden mililitr kolagenu w stężeniu 7,5 mg/mL. Następnie przenieść mieszaninę do wkładki do hodowli tkankowej z sześcioma dołkami i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po całkowitej fibrylacji nanieść na powierzchnię kolagenu 200 µL A-S-C-C-S-M w stężeniu 5 mg w pożywce hodowlanej.

Po osadzeniu mikrosfer na żelu, przygotuj żel z PEG-fibryny, wykorzystując 250 µL pożywki do hodowli komórkowych. Następnie nałóż warstwę roztworu pegylowanego fibrynogenu i trombiny na warstwy kolagenu A-S-C-C-S-M. Po zakończeniu tej czynności inkubuj konstrukty przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze z 5% carbon dioxide, aby uzyskać pełną polimeryzację.

Na koniec należy wlać 1 ml pożywki do górnej komory nad konstrukt oraz 3 ml pożywki do komory dolnej. Charakterystyka SC osadzonej w tym rusztowaniu wykazała, że SC załadowana do CSMs może zostać umieszczona pomiędzy warstwą kolagenu a PEG-fibryną, jednocześnie i w zróżnicowany sposób odbierając sygnały z obu środowisk pozakomórkowych, aby rozwijać się w nowych warunkach. Jak pokazano tutaj, kolagen wspierał zdolność ASC do pozostania komórkami macierzystymi, co zostało wykazane przez ekspresję stro-1 w kolorze zielonym, a także przez ich morfologię przypominającą fibroblasty.

W przeciwieństwie do tego, fibryna PEG indukowala różnicowanie ASC w kierunku fenotypu beznaczyniowego, co obrazuje przedstawiona tutaj morfologia rurkowata, z wyraźnym światłem oraz specyficzną dla komórek śródbłonka ekspresją czynnika von Willebranda, zaznaczoną tutaj na czerwono. Ponadto, jak tu pokazano, zaobserwowane fenotypy pojawiły się wcześnie w hodowli i utrzymywały się przez 11 dni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej szczura, ładować je na mikrosfery chito oraz wbudowywać je w dwuwarstwowy hydrożel przy użyciu biomateriałów zatwierdzonych przez FDA.

Należy pamiętać, że biomateriały i komórki wykorzystywane w tym protokole pochodzą od zwierząt i ludzi i mogą być niezwykle niebezpieczne w przypadku zanieczyszczenia patogenami od organizmów gospodarzy. Podczas wykonywania tych procedur należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak osobiste środki ochrony indywidualnej oraz aseptyczne techniki hodowli komórkowej.