In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu montażu i zastosowania sensora uszkodzeń DNA z podwójnym znakowaniem, który znakuje dwa główne typy pęknięć DNA w przekrojach tkanek. Sensor składa się z 30-merowego oligonukleotydu DNA z podwójnym znakowaniem ZI i rumiem oraz enzymu wakcynowej topoizomerazy I (vac topo), który ulega samoorganizacji. Gdy VAC topo wiąże się z 30-merem, rozpoczyna się proces działania, w którym topo przecina oligonukleotyd na końcu 3' sekwencji rozpoznawania, w wyniku czego powstaje aktywowana jednostka vac topo znakowana fitzy oraz wolna spinka znakowana aminą.

Dzięki terminalnej grupie hydroksylowej na końcu 3', jednostki są krótkotrwałe i szybko składają się z powrotem w pierwotny konstrukt, który następnie ulega rozszczepieniu. W przypadku braku dodatkowych pęknięć DNA w cząsteczce, dwie te jednostki nieustannie rozdzielają się i łączą w sposób cykliczny. Po zastosowaniu sensora molekularnego do przekrojów tkanek z uszkodzeniami DNA, jednostka detekcyjna znakowana Fitz selektywnie przyłącza się do tępokońcowych pęknięć DNA z grupą hydroksylową na końcu 5'.

Znakowana jednostka detekcyjna R domine liguje się do tępokrawędzistego pęknięcia z fosforanem na końcu 5'. W obecności ligazy DNA T four uzyskuje się wyniki obrazujące obecność oraz rozkład pęknięć DNA typu one oraz D'S two w komórkach na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod wykrywania HESIs, takich jak tunnel, jest jej większa specyficzność oraz dostarczenie dodatkowych informacji poprzez znakowanie zarówno fazy autonomicznej, jak i fagocytycznej apoptozy.

Z perspektywy nanotechnologii czujnik ten stanowi przykład podejścia opartego na biologii, które adaptuje rzeczywiste struktury i architektury biologiczne do konstrukcji nietoksycznych urządzeń w skali molekularnej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ jej sukces zależy od zastosowania wysoce aktywnego preparatu Toro SOM oraz prawidłowego przetwarzania skrawków w celu uniknięcia nadmiernego trawienia przez proteinazę K. Skrawki tkanek do tej procedury powinny zostać przygotowane przed montażem urządzenia molekularnego. Są to skrawki o grubości od pięciu do sześciu mikronów, wycinane z paraldehydu.

Zaleca się stosowanie bloków tkankowych utrwalonych w parafinie. Umieść szkiełko z przekrojem tkanki w statywie do szkiełek i usuń wosk w ksylenie przez 15 minut. Po 15 minutach przenieś preparat do świeżej kąpieli w ksylenie na dodatkowe pięć minut.

Rehydratuj preparat, przeprowadzając slajd przez następujące stężenia etanolu. 96% etanol dwukrotnie przez pięć minut każde. 80% etanol przez pięć minut, a następnie woda.

Dwa razy po pięć minut. Po rehydratacji poddać przekrój trawieniu proteinazą K. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze, używając 100 µL roztworu o stężeniu 50 µg/mL na każdy przekrój. W zależności od rodzaju tkanki czas trawienia może wymagać korekty, należy jednak uważać, aby uniknąć nadmiernego trawienia, ponieważ prowadzi ono do zaniku sygnału i uszkodzenia przekroju po zakończeniu procesu trawienia.

Przepłucz preparat na szkiełku dwa razy w wodzie destylowanej, po 10 minut za każdym razem. Nałóż 2% BSA w celu wstępnego blokowania i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej. W tym czasie złóż maszynę molekularną, zgodnie z instrukcją przedstawioną dalej w tym filmie.

Wszystkie odczynniki do montażu maszyny molekularnej są odmierzone dla całkowitej objętości 25 µL, co jest wystarczające do pojedynczej detekcji w przekroju tkanki o przeciętnej wielkości. Objętość można zwiększyć w razie potrzeby w małej plastikowej probówce. Połączyć następujące odczynniki w podanej kolejności, używając wody destylowanej.

15% glikolu polietylenowego 8 000 T, buforu ligazy DNA T4, dwuznaczonego oligonukleotydu, topoisomerazy I vaccinia oraz ligazy DNA T4 zmieszać delikatnie poprzez pipetowanie. Konstrukt molekularny niemal natychmiast ulegnie samorzece w tym roztworze i może być użyty niezwłocznie w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć procedurę znakowania pęknięć DNA, odessać roztwór blokujący z preparatu.

Nanieś 25 µL pełnej mieszaniny reakcyjnej na każdą sekcję. Przykryj sekcję plastikowym szkiełkiem podstawowym i umieść preparat w komorze z wysoką wilgotnością. Chroń przed światłem, owijając komorę folią aluminiową, i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Chociaż sygnały ligazy i topo można zaobserwować po godzinnej inkubacji, w wielu przypadkach sygnał ligazy można dodatkowo wzmocnić. Aby wzmocnić sygnał, ponownie nanieść mieszaninę reakcyjną bez vac topo i oligonukleotydu jeden, ale z oligonukleotydem trzy i T four DNA Ligase, nałożyć plastikową lamellkę na przekrój i inkubować w komorze nawilżonej przez 18 godzin. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, delikatnie zanurzyć slajd pionowo w naczyniu Coplan zawierającym wodę w temperaturze pokojowej, aby usunąć lamellkę.

Następnie przemyj preparat w wodzie destylowanej trzy razy po 10 minut. Opłucz preparat buforem z wodorowęglanu sodu. Płukanie tym roztworem zasadowym wzmacnia fluorescencję fitzy, która jest wrażliwa na pH i ulega znacznemu zmniejszeniu przy pH poniżej siedmiu.

Na koniec pokryj przekrój roztworem zapobiegającym blaknięciu, który zawiera również DPI do liczników i barwienia jąder, a następnie nałóż szkiełko zakrywowe. Przekroje są teraz gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej. Na tej rycinie przedstawiono przekrój tkanki grasicy traktowanej deksametazonem, w której maszyna molekularna wykryła pęknięcia DNA o tępych końcach typu DNAs one i DNAs two w obszarach korowych grasicy podlegających apoptozie; zielona fluorescencja cytoplazmatyczna wskazująca na pęknięcia typu DNA's two oznacza makrofagi korowe trawiące materiał jądrowy apoptotycznych tymocytów.

Sygnał ten jest wytwarzany przez vac topo i lokalizuje się w lysosomach FGA z DNA zawierającym grupę hydroksylową na końcu 5'. Pęknięcia dwuniciowe w postaci czerwonej fluorescencji wskazują na etykiety jednego typu pęknięć DNA, jądra apoptotycznych tymocytów niepochłoniętych przez makrofagi. Masowe liczby tymocytów jednocześnie ulegają apoptozie.

Towarzyszy temu powstawanie pięciu pęknięć obu nici z końcami fosforanowymi, wizualizowanych za pomocą znakowania opartego na ligazie. Pęknięcia te znajdują się na obwodzie jądra i tworzą wzory w kształcie pierścieni. Wszystkie jądra komórkowe są zabarwione na niebiesko dzięki przeciwbarwieniu dpi.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia skrawków pomiędzy kolejnymi etapami dodawania różnych roztworów. Ponadto wszystkie preparaty enzymatyczne należy przechowywać w lodzie przed dodaniem ich do skrawków, a sondy fluorescencyjne chronić przed światłem podczas reakcji znakowania oraz po jej zakończeniu. Technika ta umożliwiła wizualizację wszystkich faz rozpadu heterochromatyny w komórkach.

Niniejszy czujnik sam w sobie stanowi przykład podejścia zielonej nanotechnologii do projektowania nanocząstek, sond i maszyn w skali nano. Podejście to łączy komponenty sztuczne z naturalnie występującymi elementami maszyn molekularnych. Celem jest wyeliminowanie toksyczności oraz niekorzystnej reaktywności biologicznej tych silnie dyspersyjnych nanomateriałów.