CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie, w jaki sposób można wykorzystać chip COMET do wykonywania wysokoprzepustowych pomiarów uszkodzeń DNA w komórkach ssaków. Osiąga się to poprzez uprzednie załadowanie komórek ssaków do chipa COMET. Drugim krokiem jest traktowanie komórek substancjami chemicznymi, o których wiadomo, że powodują uszkodzenia DNA.

Następnie komórki są poddawane lizie i Electro East przy użyciu tradycyjnych protokołów testowych COMET. Ostatnim krokiem jest obrazowanie fluorescencyjne DNA komórkowego w celu wizualizacji migracji uszkodzonego DNA. Ostatecznie oprogramowanie do analizy obrazu służy do ilościowego określenia zakresu uszkodzeń DNA.

Tak więc test com istnieje od naprawdę długiego czasu i jest to bardzo przydatny test do badania wielu różnych rodzajów uszkodzeń DNA. Ale problem polega na tym, że jest to naprawdę niska przepustowość i brakuje mu czułości. Stworzyliśmy więc chip COMET, który jest w zasadzie bardzo wysokoprzepustową wersją testu COMET, która umożliwia przeprowadzanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych, na przykład w celu badań przesiewowych leków, oraz w badaniach epidemiologicznych.

Doktorant Jing GA w moim laboratorium będzie demonstrował procedurę. Chip Coma to żel z szeregiem mikro dołków wyprodukowanych z mikro spreparowanego stempla z mikro słupkami o średnicach tak małych jak pojedyncza komórka, które można rozpocząć umieszczając w jednej studzience prostokątnej z folią żelową do dołu. Po dwukrotnym umyciu żelu po 25 mililitrów w jednym XPBS ustaw chip przecinka na szklanej płytce, a następnie odpowiednio oznacz orientację żelu.

Teraz delikatnie wciśnij odwróconą płytkę 96 dołków bez dna w żel, upewniając się, że wszystkie 96 dołków znajduje się w obszarze żelu. Następnie przypnij dowolną stronę płytki 96-dołkowej do szklanej płytki za pomocą 1.5-calowych spinaczy do segregatora. Na koniec odessaj nadmiar PBS z każdego z nich.

Dobrze zebrać zawiesinę lub przylegające komórki zgodnie ze standardowymi procedurami i rozcieńczyć komórki pożywką do końcowego stężenia 100 000 do 1 miliona komórek na mililitr. Upewnij się, że zawiesinę jednokomórkową uzyskuje się, przechodząc przez filtr komórkowy, jeśli to konieczne. Odpipetuj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki, po zakończeniu płytkę z chipem komety 96 dołków.

Przykryj płytkę folią żelową, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieść ją w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza na 30 minut po wyjęciu płytki z inkubatora. Po upływie 30 minut odessaj pożywkę z każdego z nich, a następnie usuń spinki do segregatora i bezdenną płytkę 96 dołków Przytrzymaj chip komety ze szklaną płytką pod kątem i delikatnie spłucz jednym XPBS, aby usunąć nadmiar komórek na wierzchu aros. Teraz spójrz na płytkę przez soczewkę obiektywową z czterema x na mikroskopie jasnego pola, aby sprawdzić optymalne obciążenie komórek Po załadowaniu wystarczającej liczby komórek umieść chip com na równej powierzchni, nakładkę z 1% agrosem o niskiej temperaturze topnienia, który został wstępnie rozgrzany do 37 stopni Celsjusza.

Pozwól nakładce zestalić się w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, a następnie umieść ją w czterech stopniach Celsjusza na pięć minut, aby uzyskać pełną datację, aby dozować komórki interesującymi je substancjami chemicznymi. Najpierw ostrożnie wyrównaj studzienki chipa komety z dołkami nowej płytki 96-dołkowej bez dna i dociśnij. Przymocuj płytkę 96-dołkową do płytki szklanej za pomocą klipsów do segregatora, tak jak poprzednio.

Następnie umieść płytkę na lodzie i dodaj 100 mikrolitrów interesującej nas substancji chemicznej w pożądanej dawce Do każdej studzienki pozwól, aby badana substancja chemiczna pozostała na komórkach w pożądanym czasie po dozowaniu, odessać roztwór chemiczny z każdej studzienki i w razie potrzeby spłukać jednym XPBS. Pokrój żel na osobne kawałki. Następnie, aby zbadać kinetykę naprawy, dodaj pożywkę hodowlaną do studzienek, inkubuj i przystąp do lizy komórek w określonych punktach czasowych do komórek LY w celu przeprowadzenia alkalicznego testu kometowego.

Przygotuj około 25 mililitrów działającego alkalicznego buforu do lizy dla każdego chipa, dodając 1% Triton X 100 do alkalicznego roztworu podstawowego. Następnie wstępnie schłodzić w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować alkaliczny bufor do lizy do pojemnika nieco większego niż chip komety.

Następnie zanurz chip alkaliczny w schłodzonym, roboczym buforze do lizy alkalicznej, umieść w lodówce i pozwól lizie postępować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wyjmij chip komety z bufora lizy i szybko zregeneruj się jednym XPBS. Następnie umieść chip w komorze do elektroforezy stroną z folii żelowej skierowaną w dół i zabezpiecz taśmą dwustronną.

Przenieś komorę do komory chłodniczej o czterech stopniach Celsjusza i napełnij komorę zimnym alkalicznym buforem do elektroforezy do poziomu, który tylko pokryje żel. Następnie pozostaw chip w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 40 minut, aby umożliwić alkaliczne odwijanie. Na koniec uruchom żel przy jednym wolcie na centymetr i 300 miliamperach przez 30 minut.

W chłodni należy wyregulować objętość bufora elektroforezy w komorze, aby uzyskać pożądany prąd roboczy. W przypadku neutralnego testu komety należy wykonać działający neutralny bufor do lizy, dodając 1% Triton X 110% DMSO do neutralnego roztworu podstawowego do lizy. Ponownie, przygotowując około 25 mililitrów działającego buforu do lizy dla każdego chipa.

Umieść działający neutralny bufor do lizy w inkubatorze ustawionym na 43 stopnie Celsjusza, aby się rozgrzał. Po podgrzaniu neutralnego buforu do lizy zanurz chip przecinkowy w neutralnym buforze do lizy i umieść na noc w inkubatorze o temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń neutralny bufor do lizy, a następnie dwukrotnie przelej neutralny bufor do elektroforezy przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza Za każdym razem zabezpiecz chip w komorze elektroforezy i przenosi do chłodni

Tak jak poprzednio, napełnij komorę elektroforezy zimnym neutralnym buforem do elektroforezy do poziomu, który tylko pokryje żel i pozwól żelowi siedzieć w zimnym pomieszczeniu przez 60 minut, uruchom żel przy napięciu 0,6 V na centymetr i sześć miliamperów przez 60 minut w zimnym pomieszczeniu. Ponownie wyreguluj objętość bufora elektroforezy w komorze, aby w razie potrzeby uzyskać żądany prąd bieżący. Po wyjęciu chipa com z chłodni należy zneutralizować żele poprzez dwukrotne przemycie i zneutralizowanie buforu po 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pozostań w chipie z fluorescencyjnym barwnikiem DNA, takim jak cyberg gold lub bromek irydu. Zgodnie z instrukcjami producenta i obrazem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, reprezentatywne komety Microwell z nieleczonego TK, w górnym panelu tego schematu pokazano sześć limfoblastów. Te z sześciu komórek TK wystawione na działanie 50 mikromolowego nadtlenku wodoru w środkowym panelu i 100 mikromolowego nadtlenku wodoru w dolnym panelu.

Wszystkie ekspozycje trwały 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten wykres liniowy pokazuje odpowiedź na dawkę nadtlenku wodoru sześciu komórek TK. Każdy punkt danych jest średnią z trzech niezależnych eksperymentów, w których w każdym eksperymencie uzyskano medianę procentowego DNA ogona co najmniej 50 pojedynczych komet.

Ten wykres przedstawia zmienność próbki do próbki testu chipa przecinkowego dla sześciu komórek TK narażonych na dane procentowe DNA nadtlenku wodoru w każdym dołku pokazano tutaj. Każde pole reprezentuje medianę co najmniej 50 pojedynczych komet z każdego dołka. Średnia z 12 dołków wynosi 77 punktów 53%Odchylenie standardowe wynosi 3,99%a współczynnik zmienności wynosi 5,2%Ten wykres pokazuje zmienność od eksperymentu do eksperymentu.

Tę samą ekspozycję na nadtlenek wodoru powtórzono sześć razy, a dane z każdego powtórzenia są pokazane jako szary pasek. Każda ramka reprezentuje medianę procentowego DNA warkocza co najmniej 100 pojedynczych komet z każdego powtórzenia. Średnia z sześciu powtórzeń wynosi 49,57%pokazane tutaj jako tylny pasek.

Odchylenie standardowe sześciu powtórzeń wynosi 4,99%, a słupek błędu średniej wynosi 2,04%reprezentowany jako pasek powietrza na rysunku Podobnie jak tradycyjny powszechny test. Naukowcy mogą wprowadzać modyfikacje w tej procedurze lub stosować inne bałagany, takie jak włączenie oczyszczonych enzymów specyficznych dla zmian, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące rodzaju uszkodzeń DNA wytwarzanych w komórkach. Technika chipowania komety utorowała drogę do badań nad komórkami ssaków, aby dowiedzieć się więcej o uszkodzeniach i naprawie DNA.

A ponieważ jest to wysoka przepustowość, umożliwia przeprowadzenie badań klinicznych i epidemiologicznych, które wcześniej nie były możliwe ze względu na liczbę próbek.