Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Jane przeniosła się do opracowania metody elektroporacji in vivo rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy autorstwa Ling Wang, Han Jang i Johna Burgandy z Oregon Hearing Research Center w Oregon Health and Science University. Dzień dobry. Nazywam się John Burgandy. Moje laboratorium znajduje się w Oregon Hearing Research Center w Oregon Health and Science University.

Nazywam się Ang. Jestem stażystą w laboratorium prof. Johnsa. Jestem również asystentem badawczym w laboratorium prof. Johnsa.

Nasza prezentacja jest podzielona na cztery części. Pierwszą z nich jest brzuszna laparotomia. Przedstawiamy znieczulenie oparte na pentobarbitalu sodu, sposób sprawdzania skuteczności znieczulenia, ochronę rogówki, przygotowanie pola operacyjnego, dezynfekcję, arkusz danych chirurgii przeżywalności myszy, zestaw chirurgiczny, cięcie w linii środkowej brzucha przez skórę i ścianę brzuszną oraz eksternalizację rogów macicy.

Część druga to mikroiniekcja przezmaciczna. Prezentujemy doświetlanie zarodka, reorientację zarodka, mikroiniekcję, wykonanie pipety oraz mikroiniekcję do ucha w 11,5 i 12,5 dniu embrionalnym. Część trzecia to elektroporacja in vivo.

Prezentujemy sposób rozmieszczenia elektrod łopatkowych oraz elektroporację u myszy w 11,5 dniu embrionalnym. Część czwarta przedstawia reprezentatywne wyniki. Pokazujemy ekspresję GFP w ślimakach w późnym okresie embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym.

Otrzymano to w wyniku elektroporacji in vivo ucha w dniu embrionalnym 11,5 z plazmidem ekspresyjnym; część pierwsza: brzuszna laparotomia. Matka jest stabilnie unieruchomiona poprzez uchwycenie skóry za karkiem, ogona oraz lewej kończyny tylnej. Po przemyciu brzucha 70% etanolem podaje się domięśniowy zastrzyk z anestetykiem na bazie pentobarbitalu sodu.

Myszy umieszcza się w klatce domowej na od czterech do pięciu minut, aby środek znieczulający mógł zadziałać. W celu oceny stopnia znieczulenia stosuje się ucisk łapy i ogona. Ta samica drży w odpowiedzi na ucisk ogona i potrzebuje kolejnych dwóch minut, zanim przestanie reagować na bodźce szkodliwe.

Sterylna maść okulistyczna jest aplikowana do oczu, aby chronić rogówki przed wysychaniem. Przygotowanie pola operacyjnego przeprowadzamy w dygestorium, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się sierści i naskórka. Sierść zostaje zgolona cienkim ostrzem w celu odsłonięcia skóry pokrywającej ścianę brzuszną.

Całkowite usunięcie sierści ułatwia gojenie się nacięcia po operacji. Dezynfekcję skóry brzucha przeprowadza się, stosując naprzemiennie 70% etanol, Betadynę oraz ponownie 70% etanol. Zawsze przecieraj od strony rostralnej do ogonowej, używając nowej chirurgicznej kulki waty lub aplikatora z bawełnianym końcem.

Przy każdym przemyciu oceniamy głębokość i jakość oddechów podczas dezynfekcji, aby upewnić się, że samica nie reaguje. Po drugim przemyciu 70% etanolem natychmiast ułożyliśmy samicę powierzchnią brzuszną do dołu na sterylnej ściereczce i umieściliśmy ją na podgrzewanej podkładce na dwie do trzech minut w celu ogrzania. Jest to dogodny moment na zapisanie danych przedoperacyjnych w arkuszu rejestracji przeżywalności myszy podczas operacji. Do informacji uzupełniających dołączyliśmy nasz arkusz danych dotyczących przeżywalności myszy podczas operacji.

Warto dołączyć arkusz danych oraz protokół opieki nad zwierzętami, aby instytucjonalna komisja ds. opieki i użytkowania zwierząt mogła zapoznać się ze sposobem monitorowania danych przedoperacyjnych, śródoperacyjnych i pooperacyjnych. Dla każdego obiektu chirurgicznego wypełniamy jeden arkusz rejestracyjny. Preferujemy przeprowadzanie zabiegów w środowisku sterylnym, choć zazwyczaj nie jest to wymagane w przypadku gryzoni.

Powierzchnia robocza jest oddzielona od silnika dmuchawy i obudowy plenum, dzięki czemu żadne drgania nie są przenoszone na użytkownika. Do procesu mikroiniekcji dołączyliśmy w ramach informacji uzupełniających schemat modyfikacji, które wprowadziliśmy do naszej komory z laminarnym przepływem powietrza w celu ułatwienia transferu genów in utero; kluczowe zmiany obejmują niskie wyzwanie, wycięcia pod oświetlenie szynowe, ukryte gniazda zasilające dla przewodów instrumentów oraz ścieżkę prowadzenia dodatkowych obwodów elektrycznych. Zestaw chirurgiczny składa się z elektrycznego worka z roztworem Ringera z mleczanem do infuzji dożylnej, kąpieli wodnej, manipulatora XY, Z, stereofluorescencyjnego mikroskopu sekcyjnego, światłowodowego źródła światła oraz instrumentów chirurgicznych.

Pedały nożne służą do uruchamiania mikroinjektora, elektroporatora oraz ustawiania ostrości. Instrumenty chirurgiczne do mikroskopu są sterylizowane w autoklawie. Narzędzia muszą być ponownie sterylizowane pomiędzy kolejnymi myszami przy użyciu sterylizatora szklanego koralika lub poprzez ponowną autoklawację uchwytu igieł.

Niezbędnymi narzędziami są nożyczki Balli z pierścieniami oraz pęseta naczyniowa. Wykonaj nacięcie w linii środkowej brzucha, chwyć skórę pęsetą naczyniową i wytnij powłokę skórną nożyczkami z tępymi końcami, rozszerzając nacięcie do 10–14 mm. Zidentyfikuj biały, nieunaczyniony pas tkanki łącznej nazywany linea alba (białą linią) w linii środkowej brzucha i rozetnij linea alba nożyczkami z tępymi końcami.

Należy uważać, aby nie uszkodzić jelit ani podskórnych opuszek tłuszczowych w okolicy pachwinowej. Bezzwłocznie przemyć jamę brzuszną sterylnym, podgrzanym roztworem Lactated Ringer. Ocenić miejsca nacięcia skóry i ściany brzusznej pod kątem krwawienia.

Bezpośredni ucisk tępymi szczypcami zatamuje ewentualne niewielkie krwawienie; należy wyciągnąć prawy i lewy róg macicy za pomocą szczypiec z pierścieniowymi uchwytami. Delikatnie chwyć prawy róg macicy jednym z pierścieni szczypiec i przesuń macicę w stronę nacięcia w linii środkowej. Użyj wolnej ręki, aby delikatnie manipulować boczną stroną samicy, co ułatwi uchwycenie macicy.

Kleszczyków nigdy nie należy używać do ściskania macicy i wyciągania jej na zewnątrz. Ponieważ mogłoby to uszkodzić naczynia krwionośne macicy lub embriony, powtórz procedurę zewnętrznia dla lewego rogu macicy. Natychmiast przemyj nowo wyciągnięte rogi macicy uprzednio ogrzanym roztworem Ringera z mleczanem, a następnie delikatnie wprowadź z powrotem tkankę tłuszczową lub jelita, jeśli zostały one wyciągnięte wraz z macicą.

Sytuacja ta nie występuje często. Część druga: mikroiniekcja maciczna. Samicę ustawia się pod obiektywem o długiej odległości roboczej, a miękki światłowód doprowadzający światło przykłada się do ściany macicy.

Macicę delikatnie uciska się palcem wolnej ręki, aby ułatwić określenie orientacji zarodka. Światło z kabla światłowodowego powinno mieć najniższą intensywność niezbędną do dokładnej oceny orientacji zarodka.

Intensywne światło może przekazywać ciepło do macicy, co może prowadzić do powikłań. Trzymamy światłowód i macicę w jednej dłoni, a palcem wolnej ręki repozycjonujemy zarodek za pomocą delikatnej palpacji. W poniższych trzech klipach z mikroskopii EC demonstrujemy najczęściej obserwowane orientacje zarodka w macicy.

Widz zobaczy obraz mikroskopowy uzyskiwany podczas oświetlenia przeświecającego; mimo że jest ono czarno-białe, oświetlenie przeświecające macicy pozwala na wykrycie orientacji zarodka in vivo. W tym przykładzie zarodek znajduje się w pozycji odwróconej głową w dół, a jego powierzchnia brzuszna jest skierowana w stronę widza. Przesuwając macicę w przód i w tył, możemy zidentyfikować prawą i lewą kończynę tylną, ogon oraz lewą stronę głowy z okiem.

W tym przykładzie zarodek ponownie znajduje się w pozycji odwróconej głową w dół, ale jest obrócony o około 90 stopni względem osi przednio-tylnej. Poprzez delikatne poruszanie macicą w przód i w tył możemy dostrzec kształty łopatkowe, które definiują lewą kończynę tylną oraz lewą kończynę przednią. Widoczna jest również tylna część mózgu.

Zarodek znajduje się w pozycji pionowej, z lewą stroną zwróconą w stronę widza. Początkowy czwarty komora mózgu jest widoczny jako jasny obszar w tylnym mózgowiu. Widoczne są również lewe oko, lewa kończyna przednia oraz lewe kończyny tylne.

Lekki ucisk macicy pozwala na niewielką reorientację embrionów, aby umożliwić wykrycie głównego pnia głównej żyły głowowej oraz jej gałęzi przedniej i tylnej, oznaczonych odpowiednio białą i czarną gwiazdką. Jak zobaczymy, Otis znajduje się w połowie drogi między gałęzią przednią a tylną głównej żyły głowowej. Samego Otisa nie można dostrzec przez macicę za pomocą transiluminacji.

W dwóch kolejnych klipach z mikroskopii wideo demonstrujemy, jak ponownie zorientować zarodek w celu mikroiniekcji przy użyciu wspornika Otis. Celem jest zidentyfikowanie punktów orientacyjnych zarodka, które pozwalają na interpolację położenia otis w bocznej części głowy. Naszym celem jest zmiana orientacji zarodka z pozycji grzbietowej na boczną, aby umożliwić identyfikację głównej żyły głownej.

W pozycji grzbietowej widoczne są czwartą komora śródmózgowia oraz lewa kończyna przednia. Delikatny ucisk macicy zmienia orientację embrionu z grzbietowej na boczną. Lewe oko, głowa, śródmózgowie oraz czwarta komora są wyraźnie widoczne.

Główna żyła głowy oraz jej tylna gałąź, zaznaczona gwiazdką, są również wyraźne. Przednia gałąź głównej żyły głowy nie jest wyraźnie widoczna. Naszym celem jest ponownie zorientowanie zarodka w taki sposób, aby można było zidentyfikować główną żyłę głowy, lecz przy większym powiększeniu, odpowiednim do mikroiniekcji macicznej.

Na tej perspektywie bocznej widoczne są naczynia maciczne, pas decydualny oraz lewe oko. Delikatny nacisk na macicę przesuwa embrion, co pozwala na zlokalizowanie czwartej komory i lewego oka. Główna żyła głowowa i jej gałąź tylna zaznaczone są gwiazdką; główna żyła głowowa wraz z odgałęzieniami tworzą kształt przypominający słupki do futbolu amerykańskiego.

Pęcherzyk słuchowy nie jest widoczny przez macicę, ale znajduje się w centrum prowadnic. Lynn rozpoczęła sekwencję wstrzykiwania dla jednego zarodka. Wykorzystuje transiluminację macicy, ponownie ustawia zarodek do mikroiniekcji i wprowadza do pola widzenia mikropipetę do iniekcji wypełnioną barwnikiem fast green.

Pipeta do mikroiniekcji jest przymocowana do uchwytu pipety, który jest trzymany przez mikromanipulator w osiach X, Y i Z. Magnetyczna podstawa manipulatora jest przymocowana do stalowej płyty z teflonową podstawą, co umożliwia łatwe pozycjonowanie wstępne pipety do mikroiniekcji. Igłę wysuwa się w odpowiedni sposób, używając pokrętła mikrometru przesuwu w manipulatorze.

Wykonane pipety są niezbędne do traumatycznej mikoiniekcji do wczesnego embrionu myszy w stadium Otis. Wyciągamy gronościenne kapilary borokrzemowe za pomocą poziomego wyciągacza do pipet. Powstałą pipetę pokazaną w A łamiemy ręcznie pęsetą w miejscu o średnicy zewnętrznej około 14 do 16 mikronów, wskazanym przez grot strzałki w B. Chropowate przełamanie pipety pokazane w C jest poszarpane i kruche.

Ustawiamy pipetę pod kątem około 20 stopni, aby zaostrzyć jej końcówkę, jak pokazano na panelu D; parametry wyciągania i ścięcia pipet do mikroiniekcji podano w tekście towarzyszącym. W dwóch kolejnych klipach z mikroskopii wideo demonstrujemy mikroiniekcję do pęcherzyka słuchowego myszy w 11,5 i 12,5 dniu embrionalnym. Naszym celem jest zaprezentowanie mikroiniekcji do pęcherzyków słuchowych myszy w 11,5 dniu embrionalnym.

Najpierw wykonujemy wstrzyknięcie do jam pęcherzykowych bez obecności macicy, aby jednoznacznie pokazać, jak wygląda prawidłowo skierowane wstrzyknięcie. Następnie demonstrujemy autentyczne mikro-wstrzyknięcie transuterine. W przypadku tego pierwszego wstrzyknięcia macica została nacięta wzdłuż, aby umożliwić wypchnięcie worka trzewnego, a następnie usunięto pas decyzualny pokrywający trzewny worek żółtkowy.

Łożysko pozostaje przytwierdzone do macicy, a embrion jest żywy. Po częściowym usunięciu macicy widoczna jest czwarta komora, główna żyła głowowa oraz jej odgałęzienia przednie i tylne, pipeta oraz przybliżona lokalizacja torbieli zaznaczona na biało. Na początku tej sekwencji wtryskiwania stwierdzono przepływ krwi w naczyniach trzewnego pęcherzyka żółtkowego.

Pipetę przesunięto przez wisceralny worek żółtkowy i wstrzyknięto dai do woreczka otycznego, grzbietowo do przewodu endolimfatycznego, a pozycję otocystu wyznaczono w centrum struktur pionowych. Otocyst znajduje się w połowie odległości między przednią a tylną gałęzią głównej żyły głownej; mikroiniekcja do embrionalnego otocystu myszy w dniu 11,5 wymaga zlokalizowania głównej żyły głownej i przynajmniej jednej z jej gałęzi w celu oszacowania położenia otocystu.

W tym przykładzie schematycznym naszym celem są zarówno przednia, jak i tylna gałąź głównej żyły głowowej, a obszar OUC został zaznaczony na biało. Bardziej realistyczna prezentacja embrionu to taka, w której wykryty zostaje główny pień głównej żyły głowowej wraz z tylko jedną z jej gałęzi; w przedstawionym przykładzie widoczna jest jedynie tylna gałąź głównej żyły głowowej, co jednak wystarcza do interpretacji położenia otyków. Przez macicę wprowadzana jest PT, a do otyków wstrzykiwany jest barwnik.

Czekamy 30 sekund, aby barwnik mógł wypłynąć z jamy owodniowej, po czym staje się widoczny grzbietowo przewód endolimpfatyczny oraz przedsionek. Kończymy widokiem przy niskim powiększeniu zarodka, w którego pęcherzyk właśnie wstrzyknięto substancję, aby zapewnić perspektywę anatomiczną w tym ujęciu; widoczne są czwarta komora, lewe oko oraz naczynia krwionośne macicy. Prezentujemy transmikroiniekcję do pęcherzyka słuchowego zarodka myszy w 12. dniu rozwoju oraz mikroiniekcję do powstającej czwartej komory tylnego mózgowia.

Transiluminacja pozwala na zlokalizowanie głównej żyły głownej w tym widoku bocznym lewym, a także oka. Pipetę wprowadza się przez macicę do pęcherzyka słuchowego i wstrzykuje barwnik, aby wypełnić jego światło. W celu wstrzyknięcia substancji do czwartej komory, obracamy embrion o 90 stopni, aby uzyskać widok grzbietowy tylnego mózgu.

Wstrzyknięta lewa cysta znajduje się obecnie po lewej stronie. Pipetę przesunięto przez macicę, a fast green zmieszany z lor. Skoniugowany dekstran zostaje wstrzyknięty do czwartej komory.

Należy zauważyć, że wstrzyknięta objętość barwnika nie przenika do śródmózgowia in vivo. Po wstrzyknięciu ocenia się fluorescencję, aby potwierdzić lokalizację dekstranu w czwartej komorze. Następnie embrion jest orientowany z pozycji grzbietowej na boczną.

Przewód endolimpatyczny znajduje się bezpośrednio brzusznie względem czwartej komory w tym widoku bocznym. Fluorescencja in vivo potwierdza lokalizację dekstranu w czwartej komorze. Po urodzeniu przesiewowo badamy szczenięta pod kątem zielonej fluorescencji w czwartej komorze, korzystając z mikroskopu epifluorescencyjnego.

Szczury pod mikroskopem stereoskopowym z zieloną fluorescencją w tylnej części mózgu posiadają ucho wewnętrzne, które poddano manipulacji podczas embriogenezy część trzy w ramach elektroporacji in vivo. Po napełnieniu cysty plasmidem ekspresyjnym, macicę przemywa się świeżo przygotowanym, podgrzanym roztworem Ringera z mleczanem. Transiluminacja ułatwia centrowanie cysty ODU w polu elektrod.

Metalowa końcówka światłowodu zostaje wycofana z powierzchni macicy. Przed rozpoczęciem serii impulsów prostokątnych, w następnym klipie z mikroskopii prezentujemy pełny cykl elektroporacji in vivo. Elektroporacja pęcherzyka słuchowego myszy w 11,5 dniu embrionalnym wymaga delikatnego umieszczenia elektrod płytkowych na macicy.

W tym przykładzie lewa cysta otyczna została wypełniona plazmidem ekspresyjnym, a macica została świeżo przepłukana roztworem Ringera z mleczanem. Katoda jest rozmieszczona bocznie względem wypełnionej cysty otycznej, a anoda jest rozmieszczona przyśrodkowo. Na początku sekwencji działania cysta otyczna znajduje się w centrum pola elektrod. Macicę delikatnie uciśnięto, a następnie za pomocą pedału przełącznika zainicjowano serię impulsów o przebiegu prostokątnym.

Idealnie podczas każdego impulsu dostarczany jest prąd o natężeniu od 60 do 100 mA. Następnie macica zostaje zwolniona i niezwłocznie przemyta. Świeżo przemyta macica zostaje wprowadzona z powrotem do jamy brzusznej poprzez delikatny nacisk kleszczy pierścieniowych.

Po wprowadzeniu macicy do wnętrza ciała, jamę brzuszną płucze się około 4 ml roztworu Ringera z mleczanem, pozostawiając około 1 ml roztworu Ringera w jamie brzusznej, aby pomóc w utrzymaniu nawodnienia samicy, która bezpośrednio po operacji jamy brzusznej będzie pić mniej wody niż zazwyczaj. Ścianę brzucha, a następnie skórę zszywa się nicią wchłanialną przy użyciu igłotrzymacza. Nasz igłotrzymacz posiada wbudowane nożyczki, które ułatwiają zamykanie rany.

W przypadku zarówno ściany brzusznej, jak i skóry, preferujemy szew ciągły. Co drugi ścieg jest blokowany w celu zapewnienia dodatkowego wsparcia w miejscu nacięcia. Przed umieszczeniem samicy w klatce pooperacyjnej podajemy podskórnie niesteroidowy lek przeciwzapalny.

Skonsultuj się z personelem weterynaryjnym w celu ustalenia, które środki przeciwbólowe profilaktyczne są preferowane przez Twoją instytucjonalną komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Matka jest owinięta w sterylną tkaninę i umieszczona na dnie podgrzewanej klatki rekonwalescencyjnej. Klatka rekonwalescencyjna zawiera materiał do gniazdowania, czerwoną rurkę służącą jako schronienie, karmę laboratoryjną oraz butelkę z wodą.

Klatka zostaje ponownie złożona z osłoną filtra na górze rano po operacji. Samica jest zadbana, porusza się i potrafi utrzymać równowagę na tylnych kończynach, próbując zbadać otwartą górną część klatki. Linia szwów na brzuchu jest czysta, sucha i nie wykazuje oznak rozstąpienia, zaczerwienienia ani obrzęku.

Dołączyliśmy dokument omawiający opracowanie protokołu opieki nad zwierzętami w przypadku transferu genów in utero. Dokument zawiera sformułowania, które mogą być pomocne podczas projektowania protokołu specyficznego dla danej instytucji, w konsultacji z komisją ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Część czwarta, reprezentatywne wyniki.

Reprezentatywne wyniki na panelach A i B przedstawiają reprezentatywną ślimaka z szczenięcia w szóstym dniu po urodzeniu, któremu w 11,5 dniu embrionalnym wstrzyknięto do otocysty plazmid ekspresyjny wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego, a następnie przeprowadzono elektroporację. Ścianę boczną ślimaka usunięto z części środkowej i wierzchołka. Ekspresja GFP występuje jedynie od podstawy do części środkowej ślimaka i odpowiada rozmieszczeniu markera komórek rzęsatych myosin seven A pokazanego na panelu B. Panel C przedstawia projekcję konfokalną przy niskim powiększeniu z dnia embrionalnego.

Organ Corde myszy w 18,5 dniu rozwoju, barwiony immunochemicznie przeciwciałem przeciwko miozynie 7A; komórki przetransfekowane są rozmieszczone w całym organie Corde. Panel D przedstawia powiększoną projekcję konfokalną organu Corde myszy z 18,5 dnia embrionalnego, barwionego cin.Seven.

Ekspresję GFP wykryto w komórkach rzęsatych wewnętrznych i zewnętrznych, komórkach interphalangealnych, komórkach filarowych oraz komórkach TER. Elektroporacja pośrednicząca w transferze genów do ucha w 11,5 dniu embrionalnym transfekuje progenitory, z których powstają wszystkie typy komórek tworzących narząd Cortiego.