Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest elektroporacja implantów siatkówki myszy reporterami transkrypcyjnymi fluorescencyjnymi oraz ilościowe określenie poziomu ich ekspresji. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie tkanki siatkówki myszy noworodkowej za pomocą dysekcji. Drugim krokiem procedury jest elektroporacja siatkówki konstruktami reporterowymi DNA fluorescencyjnego.

Trzecim krokiem procedury jest hodowla elektroporowanych siatkówek w formie implantów przez osiem dni. Ostatnim krokiem procedury jest pobranie eksplantu siatkówki i ilościowe określenie poziomów ekspresji reporterów fluorescencyjnych. W rezultacie można uzyskać wyniki ukazujące względne poziomy ekspresji różnych konstruktów reporterowych promotorów w rozwijającej się siatkówce myszy poprzez elektroporację eksplantów, a następnie ilościową analizę danych.

Nazywam się Joe Corbo i jestem pracownikiem naukowym w Katedrze Patologii i Immunologii w Washington University School of Medicine w St. Louis. Dzisiaj zaprezentujemy protokół wideo demonstrujący technikę elektroporacji ex vivo w siatkówkach noworodków myszy w celu ilościowego oznaczenia aktywności specyficznych dla fotoreceptorów elementów regulacyjnych CYS. Protokół ten zaprezentuje doktorantka z mojego laboratorium, Cindy Montana. W pierwszej kolejności, w przygotowaniu do pobrania gałek ocznych, należy wysterylizować komorę do elektroporacji oraz wszystkie instrumenty za pomocą 70% etanolu.

Zdezynfekuj obie rękawiczki oraz blat etanolem i zachowaj warunki sterylne przez cały czas trwania procedury. Następnie, w komorze do hodowli tkankowej, pipetuj 6 mL medium do sekcji do jednej sterylnej szalki Petriego o średnicy 60 mm oraz 3 mL medium do dwóch sterylnych szalek o średnicy 35 mm. Po powrocie do blatu zdezynfekuj głowę i szyję noworodka myszy 70% etanolem.

Po szybkim odcięciu głowy za pomocą nożyczek, przenieś ją do sterylnej szalki 100 mm, a następnie za pomocą małych nożyczek odetnij skórę głowy, aby odsłonić oczy pod mikroskopem stereoskopowym. Używając zakrzywionej pęsety, delikatnie wyjmij oko z oczodołu, a następnie umieść je w szalce 35 mm zawierającej medium do sekcji. Kontynuuj pobieranie oczu w taki sposób, aby na każdą alikwot DNA do elektroporacji przypadały trzy do czterech oczu, przechowując oczy i medium do sekcji w temperaturze pokojowej do zakończenia procesu.

Zdezynfekować żyletkę oraz opakowanie sterylnej plastikowej pipety transferowej 70% etanolem, a następnie za pomocą żyletki odciąć końcówkę pipety na odpowiedniej wysokości, aby umożliwić pobranie całego oka. Używając poszerzonej pipety, przenieść jedno oko z szalki 35 mm do szalki 60 mm pod dużym powiększeniem mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą precyzyjnej pęsety usunąć z powierzchni oka wszelkie tkanki, takie jak mięśnie pozagałkowe i tłuszcz.

Następnie usuń nerw wzrokowy, odrywając go poprzez uciśnięcie u podstawy. Aby wyizolować siatkówkę, wykonaj niewielki otwór w twardówce na wysokości limbusa; twardówka oraz nabłonek pigmentowy siatkówki wydają się błyszczące w porównaniu do tkanki siatkówki, która ma matowoszary kolor. Wprowadź po jednym ramieniu z obu par pęset do otworu i ostrożnie rozdarj twardówkę oraz nabłonek pigmentowy siatkówki.

Należy pozostawić soczewkę na miejscu. Za pomocą poszerzonej pipety przenieść wypreparowaną siatkówkę do drugiej szalki 35 milimetrowej zawierającej pożywkę. Zebrać wszystkie siatkówki i przechowywać je w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C.

Przed rozpoczęciem elektroporacji, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, dla każdej porcji DNA przeznaczonej do elektroporacji napełnić jedną sterylną szalkę 35 mm medium do sekcji, a drugą medium hodowlanym. Za pomocą pipety P 200 wypłukać komory w szalce do elektroporacji sterylnym 1X PBS trzy razy. Napełnić komory 60 µl aliquotami DNA, a wszystkie niewykorzystane komory uzupełnić 60 µl 1X PBS.

Podłącz elektrody do szalki do elektroporacji i wprowadź odpowiednie ustawienia w elektroporatorze. Za pomocą precyzyjnej pęsety chwyć siatkówki za soczewkę i przenieś je do komór elektroporacyjnych, umieszczając do czterech siatkówek w każdej komorze.

Ustaw siatkówki w taki sposób, aby soczewka opierała się o metalowy pręt przymocowany do elektrody dodatniej. Przecieraj pęsetę pomiędzy każdą komorą, aby uniknąć przeniesienia DNA z jednej komory do następnej. Po wyrównaniu wszystkich siatkówek naciśnij przycisk start w elektroforze.

Na pręcie metalowym przymocowanym do elektrody ujemnej powinny pojawić się małe pęcherzyki. Odłącz elektrody i za pomocą pęsety wyłącz urządzenie do elektroforezy. Ostrożnie odsuń siatkówki od ścianek komory.

Przenieś siatkówki z komór do szalek 35 mm zawierających medium do sekcji. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieś siatkówki z medium do sekcji do szalek 35 mm zawierających medium hodowlane. Opisz dołki sterylnej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami i napełnij każdy dołek 3 ml medium hodowlanego.

Za pomocą sterylnej pincety umieść okrągłe filtry Watman Nucleo na powierzchni medium w każdym dołku, tak aby błyszcząca strona filtrów była skierowana do góry. Przy użyciu stereomikroskopu przenieś pojedynczą siatkówkę na filtr za pomocą sterylnej pipety transferowej, kierując stronę soczewki w dół. Jeśli siatkówka spocznie stroną soczewki do góry, wciągnij ją z powrotem do pipety i spróbuj ponownie.

W każdej studzience należy umieścić nie więcej niż cztery siatkówki, utrzymując je w osobnych kroplach. Po umieszczeniu siatkówek w studzienkach, przenieś płytkę hodowlaną do inkubatora do hodowli tkankowych ustawionego na 37°C i inkubuj przez pożądany czas. Zazwyczaj ośmiodniowy okres, przedstawiony tutaj, prowadzi do pomyślnej elektroporacji i ekspresji konstruktu DNA na obszarze od jednej czwartej do jednej trzeciej powierzchni siatkówki.

Poziomy fluorescencji są ilościowo określane poprzez porównanie jednorodnie elektroporowanych obszarów wykazujących ekspresję konstruktu CRE do obszarów poza siatkówką, a następnie normalizację do kontrolnej ekspresji GFP. Wykazano, że fotoreceptory pręcikowe są szczególnie wydajnie transdukowane. Poniżej przedstawiono wyniki elektroporacji, w której dwa promotory specyficzne dla pręcików sterują ekspresją GFP oraz DS red w zewnętrznej warstwie jądrowej.

Poprzez nałożenie dwóch wzorów ekspresji na barwienie DPI przedstawione tutaj na niebiesko, widoczna jest ekspresja specyficzna dla fotoreceptorów. Nie stwierdzono ekspresji ani w warstwie międzyjądrowej, ani w warstwie komórek zwojowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić sekcję i hodowlę eksplantów siatkówki mysiej w celu ilościowego określenia aktywności elementów regulacyjnych cyst siatkówki.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.