Ocena ekspresji GFP i żywotności z wykorzystaniem cytometru obrazowego Tali
17 listopada 2011
Niniejszy protokół opisuje sposób wykonywania testów żywotności komórek oraz ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru obrazowego Tali.
Niniejszy film prezentuje procedurę oznaczania żywotności komórek wykazujących ekspresję GFP przy użyciu cytometru obrazowego tally. Komórki z transdukcją GFP barwi się za pomocą zestawu do oznaczania żywotności tally viability kit dead cell red, który barwi wszystkie martwe komórki na czerwono za pomocą jodku propidyny. Następnie komórki przenosi się pipetą na szkiełko do analizy komórkowej tally i umieszcza w cytometrze, który pozyskuje i analizuje obrazy w świetle przechodzącym oraz obrazy fluorescencji czerwonej i zielonej. Następnie generowane są histogramy przedstawiające liczbę komórek, wielkość komórek, intensywność fluorescencji PI oraz intensywność fluorescencji GFP w porównaniu z tradycyjną cytometrią przepływową.
System Tali może dostarczyć podobnych danych dotyczących żywotności i ekspresji komórek. Jednak ta cytometria oparta na obrazowaniu dostarcza dodatkowych informacji wizualnych na temat badanej populacji komórek. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa czy mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że cytometr obrazujący Tally dostarcza jednocześnie informacji ilościowych i wizualnych na temat próbki komórkowej.
Dodatkowo urządzenie do zliczania jest łatwiejsze w obsłudze, tańsze i zajmuje mniej miejsca niż cytometr przepływowy czy mikroskop fluorescencyjny. Pozwala to badaczom na szybkie przeprowadzanie ilościowych analiz, takich jak ocena żywotności komórek ekspresujących GFP, bezpośrednio na blacie laboratoryjnym. W tej procedurze komórki U2 OS o stężeniu 1×10⁶ komórek/ml zostały przetransdukowane wirusowym konstruktem GFP celowanym do jądra komórkowego, a martwe komórki zabarwiono jodekiem propidyny; następnie 100 µL zawiesiny komórkowej przeniesiono do nowej probówki do mikrocentryfugi.
Należy zauważyć, że do analizy zaleca się stężenie od 1 × 10⁵ do 1 × 10⁷ komórek na mililitr, choć stężenie nie musi być dokładne. Następnie należy dodać 1 µL odczynnika Tally Dead Cell Red. Po czym krótko wymieszać na wstrząsarku typu vortex i inkubować mieszaninę odczynnika barwiącego i komórek w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez od 1 do 5 minut.
Po inkubacji należy niezwłocznie przystąpić do analizy przy użyciu cytometru obrazowego tally. W urządzeniu tally stosuje się jednorazowe plastikowe slajdy do analizy komórkowej, zaprojektowane specjalnie dla tego instrumentu. Podczas ładowania slajdu należy go zawsze trzymać za krawędzie.
Powoli pipetuj 25 µL próbki do jednego z półksiężycowatych obszarów ładowania próbek. W komorze A ładuje się niebarwione, nietransdukowane komórki kontrolne, a w komorze B barwione komórki wykazujące ekspresję GFP. Aby przeprowadzić analizę żywotności komórek wykazujących ekspresję GFP, dotknij pola G-F-P-R-F-P na ekranie głównym cytometru. Następnie po prawej stronie pojawią się opcje analizy; wybierz GFP plus viability.
Następnie instrument zapyta, czy należy nazwać serię próbek. Naciśnij przycisk „name now”. Następnie za pomocą ekranu dotykowego wpisz nazwę serii próbek i naciśnij „save”; cytometr tally automatycznie przejdzie do ekranu pomiaru.
Następnie, aby zmierzyć fluorescencję tła, naciśnij kartę background w dolnej prawej części ekranu pomiarowego, tak jak pokazano tutaj. Ustawienie domyślne wskazuje, że obrazowane będzie dziewięć pól komórek. Teraz, kierując próbkę kontrolną w stronę przeciwną do instrumentu, włóż preparas do otworu załadunkowego, aż do zatrzymania.
Aby wprowadzić nową, niebarwioną kontrolę komórkową, nie należy naciskać z siłą ekranu w tle. Preparat zostanie automatycznie wciągnięty do instrumentu, a na ekranie pojawi się obraz komórek w czasie rzeczywistym. Za pomocą pokrętła ostrości należy ustawić komórki w odpowiedniej płaszczyźnie widzenia podczas ustawiania ostrości.
Przesuń czerwony przycisk powiększenia na 4 x lub 16 x. Aby lepiej widzieć populację komórek, powinny być one jednolicie ciemne z jasną otoczką wokół każdej z nich. Jak pokazano tutaj, liczba komórek może zostać niedoszacowana, gdy przejście między tłem a krawędziami komórek jest rozmyte, przez co granice komórek nie są wyraźnie zdefiniowane.
Komórki mogą zostać policzone w nadmiarze, gdy posiadają jasne centra i ciemne obrysy. Po ustawieniu ostrości komórek należy dotknąć lub nacisnąć przycisk, aby uruchomić kontrolę dla niebarwionych komórek. W celu pomiaru fluorescencji tła cytometr automatycznie przechwyci obrazy i wyświetli miniatury każdego pola widzenia.
Pasek postępu zapewnia bieżące aktualizacje stanu analizy. Po zakończeniu przechwytywania obrazu cytometr automatycznie wysuwa preparat i dostarcza dane z analizy przechwyconych obrazów. Przechowywane dane są wyświetlane w menu rozwijanym w karcie tła.
Próbka kontrolna tła otrzyma tę samą nazwę, co próbka eksperymentalna. Aby przeprowadzić analizę próbki transdukowanej GFP barwionej PI, należy wyjąć preparat z urządzenia, obrócić go i ponownie włożyć tak, aby próbka transdukowana była skierowana w stronę przeciwną do urządzenia. Naciśnij zakładkę próbki, a następnie dotknij przycisku wstawiania nowej próbki.
Gdy obraz pojawi się na ekranie, należy użyć pokrętła ostrości, aby wyostrzyć obraz komórek. Następnie, jak wcześniej, należy nacisnąć przycisk „run sample”, aby uruchomić analizę próbki. Po zakończeniu przechwytywania obrazu dane z analizy zostaną wyświetlone w zakładce próbki, a cytometr automatycznie i w odpowiedni sposób wysunie preparat.
Utylizuj preparat do analizy komórkowej Tally. Ze względu na to, że są to odpady biologicznie niebezpieczne, preparaty te nie mogą być używane ponownie. Po przeprowadzeniu analizy próbki można zastosować odpowiednie progi odcięcia.
Aby przeanalizować tutaj konkretne populacje komórek, dostosujemy progi w celu określenia odsetka komórek żywych i martwych. W zakładce próbki, w sekcji komórek wykazujących ekspresję GFP, podana jest liczba i procent komórek wykazujących ekspresję GFP, martwych komórek wykazujących ekspresję GFP oraz całkowita żywotność. Wyświetlane są również średnia wielkość komórki, liczba policzonych komórek oraz stężenie komórek.
Dodatkowo w dolnej części ekranu wyświetlane są histogramy przedstawiające wielkość komórek oraz fluorescencję zieloną i czerwoną. Aby ustawić bramkę wielkości komórek, dotknij miniatury wielkości komórek, aby otworzyć odpowiedni histogram i wykluczyć resztki komórkowe (debris). Przesuń niebieskie suwaki, aby wykluczyć zarówno zdarzenia zbyt duże, jak i zbyt małe.
Dotknij przycisku „apply”, aby uwzględnić komórki znajdujące się w obrębie bram. Następnie, aby dodać fluorescencję GFP do analizy, dotknij miniatury histogramu GFP, aby go otworzyć.
Przesuń niebieski suwak, aby ustawić próg tuż po prawej stronie najniższego piku. Jako pomoc posłuż się próbką kontrolną. Pozwoli to na uwzględnienie w analizie komórek GFP-dodatnich przy jednoczesnym wykluczeniu komórek autofluorescencyjnych.
Autofluorescencja jest często obserwowana, gdy cząsteczki biologiczne wewnątrz komórek są poddawane działaniu laserów. Zastosuj potwierdzenie i powróć do poprzedniego ekranu. Dane wyświetlane w zakładce próbki powinny teraz odzwierciedlać bramki i progi ustawione dla obu kanałów fluorescencji. Następnie, aby oddzielić komórki zabarwione PI od autofluorescencji lub jakiegokolwiek tła obecnego w próbce, naciśnij miniaturę histogramu PI, aby ponownie go otworzyć.
Szczyt próbki kontrolnej zostanie wyświetlony na histogramie jako szczyt szary. Szczyt czerwony odpowiada fluorescencji próbki. Fluorescencja tła jest wyświetlana jako szczyt znajdujący się najbliżej wartości zero RFU w tym urządzeniu.
Aby wyeliminować fluorescencję tła w kanale PI, przesuń niebieski suwak w celu dostosowania progu odcięcia. Aby wykluczyć ten pik, użyj szarego piku z próbki kontrolnej jako punktu odniesienia. Po odpowiednim ustawieniu progu w kanale PI dotknij przycisku zatwierdź, aby potwierdzić i powrócić do poprzedniego ekranu; urządzenie do zliczania ponownie automatycznie przeanalizuje dane i zaktualizuje wyniki w zakładce próbek.
Następnie, aby wizualnie potwierdzić prawidłowe przypisanie każdej komórki, należy nacisnąć kartę przybliżania (zoom), a następnie wybrać do przeglądu przechwycone pole widzenia, naciskając miniaturę obrazu. Następnie należy nacisnąć kartę warstw (layers). W kolejnym kroku należy nacisnąć przycisk GFP lub PI, aby wyświetlić obraz przechwycony w danym kanale.
Naciśnij ten sam przycisk ponownie, aby usunąć warstwę z wyświetlacza lub nałożyć warstwy na siebie; dotknij przycisków odpowiadających poszczególnym kanałom, aby sprawdzić, w jaki sposób zliczano komórki w danym kanale. Zakreślone okręgi oznaczają komórki zliczone wyłącznie w kanale jasnego pola, które nie wykazują fluorescencji – zostaną one obwiedzione na niebiesko. Wskazuje to, że dana komórka jest żywą komórką wykazującą ekspresję w kanale zielonym.
Komórki wykazujące ekspresję GFP zostaną obwiedzione na zielono w kanale czerwonym. Komórki barwione PI zostaną obwiedzione na czerwono i są to komórki martwe liczone w obu kanałach. Komórki widoczne w kanale czerwonym i zielonym zostaną obwiedzione na żółto.
Wskazuje to, że komórka wykazuje ekspresję GFP, ale jest również zabarwiona pi, a zatem jest martwa. Okazyjnie na ekranie może pojawić się czarne koło. Są to obiekty, które zostały zidentyfikowane, lecz wykluczone z analizy ze względu na rozmiar komórek.
Należy kontynuować precyzyjne dostrajanie progu na histogramie fluorescencji, stosując opisane wcześniej kroki, aż do momentu, gdy każda komórka wykazująca fluorescencję zostanie otoczona obwódką w odpowiednim kolorze. Wszystkie parametry analizy są automatycznie zapisywane w urządzeniu w zakładce danych.
Licznik może przechowywać pliki danych z 500 serii pomiarowych. Każdy plik zapisany w karcie danych jest dostępny do ponownej analizy. Po wybraniu pliku z karty danych zostanie on ponownie otwarty, a wszystkie histogramy i warstwy staną się aktywne, co umożliwia archiwizację danych oraz generowanie raportów.
Dane zapisane w urządzeniu można przenieść na komputer za pomocą dysku USB. Cztery reprezentatywne typy komórek zostały przetransdukowane wirusowym konstruktem GFP, będącym białkiem fluorescencyjnym skierowanym do jądra komórkowego, a następnie zabarwione zestawem Tally Viability Kit przy użyciu odczynnika Dead Cell Red i przeanalizowane za pomocą Tally w cytometrze przepływowym, jak pokazano tutaj. Obie metody wykazały w przybliżeniu taki sam procent populacji dla każdego typu komórek wykazujących ekspresję GFP, a także procent całkowitej populacji, która była jednocześnie żywotna i wykazująca ekspresję GFP.
Dane te wykazują, że cytometr Tali jest w stanie odróżnić całkowitą ekspresję GFP w populacji od ekspresji GFP w populacji żywych komórek. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykorzystania cytometru obrazowego Tali do oceny ekspresji fluorescencji i żywotności w próbce komórek. Technologia ta wypełnia lukę między badaniami pojedynczych komórek a badaniami populacyjnymi.
Korzystając z cytometru obrazowego tally, można gromadzić ilościowe i jakościowe informacje wizualne na temat pojedynczych komórek, jak i większych populacji komórkowych. Stosując tę samą procedurę, można przeprowadzić kilka innych analiz, w tym badanie apoptozy, ekspresji RFP oraz żywotności komórek. W przypadku komórek niewyrażających określonych białek, potencjalne zastosowania obejmują zarówno ocenę ekspresji genów, jak i badania skuteczności leków.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje sposób przeprowadzania testów żywotności komórek oraz ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru obrazowego Tali. Metoda ta pozwala badaczom na analizę populacji komórek z wykorzystaniem danych ilościowych i wizualnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Cytometria
Wstęp
- Cytometr obrazowy Tali stanowi alternatywę dla tradycyjnej cytometrii przepływowej.
- Umożliwia on jednoczesne pozyskiwanie danych ilościowych i wizualnych.
- Metoda ta jest przyjazna dla użytkownika i kosztowo efektywna.
- Nadaje się ona do analizy komórek exprimujących GFP.
Cel badania
- Ocena żywotności komórek wykazujących ekspresję GFP.
- Wykazanie zalet cytometrii obrazowej w stosunku do metod tradycyjnych.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu korzystania z cytometru obrazowego Tali.
Zastosowane metody
- Transdukcja komórek U2 OS białkiem GFP.
- Barwienie odczynnikiem Tali Dead Cell Red.
- Nakładanie próbek na slajdy do analizy komórkowej Tali.
- Wykorzystanie cytometru obrazowego Tali do analizy.
Główne wyniki
- Dane ilościowe dotyczące żywotności komórek i ekspresji GFP.
- Wizualna reprezentacja populacji komórek.
- Histogramy przedstawiające wielkość komórek i intensywność fluorescencji.
- Porównanie wyników z tradycyjną cytometrią przepływową.
Wnioski
- Cytometr obrazowy Tali jest skuteczny w ocenie żywotności komórek.
- Zapewnia on dodatkowe informacje wizualne na temat populacji komórek.
- Metoda ta jest dostępna do użytku laboratoryjnego w warunkach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Cytometr obrazowy Tali wypełnia lukę między cytometrią przepływową a mikroskopią fluorescencyjną, dostarczając jednocześnie ilościowych i wizualnych danych dla testów żywotności komórek oraz ekspresji GFP. Ta podwójna możliwość generowania wyników wspiera wczesne etapy badań odkrywczych, w których potwierdzenie fenotypowe i ograniczanie ryzyka mechanistycznego wymagają zarówno wskaźników na poziomie populacji, jak i wizualizacji pojedynczych komórek. Kompaktowe wymiary urządzenia, niższy koszt oraz uproszczona obsługa umożliwiają zdecentralizowane wykorzystanie w zespołach biologii odkrywczej i rozwoju testów, co zmniejsza zależność od centralnych jednostek badawczych i przyspiesza podejmowanie decyzji go/no-go w procesach walidacji celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację ekspresji GFP ze statusem żywotności w populacjach żywych komórek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wizualne potwierdzenie wydajności transfekcji i lokalizacji białka wraz z ilościowymi odczytami żywotności.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez odróżnienie całkowitej ekspresji GFP od ekspresji w komórkach żywych, co redukuje liczbę fałszywie dodatnich wyników.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane histogramy wielkości komórek, fluorescencji PI oraz intensywności GFP, co umożliwia bramkowanie oparte na progach w celu reprodukowalnej analizy populacji.
- Skalowalność: Przetwarza tysiące komórek na próbkę przy zachowaniu spójnego obrazowania i analizy algorytmicznej, co wspiera kampanie przesiewowe o średniej przepustowości.
- Integracja z przepływem pracy: Wyniki są kompatybilne z późniejszą analityką służącą do wyboru trafień (hit selection) i optymalizacji wiodących związków w badaniach fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia spójność analiz od etapu walidacji odkrycia po modele przedkliniczne, dostarczając danych dotyczących żywotności i ekspresji porównywalnych z wynikami cytometrii przepływowej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wizualne nakładanie sygnałów z jasnego pola, GFP i PI potwierdza ko-lokalizację ekspresji transgenu i śmierci komórkowej, co pozwala na wyjaśnienie mechanizmu działania.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację frakcji żywych komórek wykazujących ekspresję transgenu w populacjach heterogenicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Cytometr Tali wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – w którym jednoczesna ocena żywotności i ekspresji genu reporterowego pozwala określić wpływ związków na kondycję komórek oraz stopień oddziaływania na cel.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie aktywności reportera GFP z przeżywalnością komórek, co pozwala na rozróżnienie efektów celowanych od efektów pozacelowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników fluorescencji i żywotności wraz z walidacją wizualną, co zwiększa powtarzalność testów i potwierdzenie trafień.
- Analityka: Zapewnia odczyty w formie histogramów dla wielkości komórek, intensywności GFP oraz intensywności PI, umożliwiając porównania statystyczne pomiędzy różnymi warunkami i powtórzeniami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość danych w przepływach pracy przedklinicznych poprzez odzwierciedlenie wyników cytometrii przepływowej przy jednoczesnym dodaniu kontekstu wizualnego dla interpretacji mechanistycznej.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Funkcjonuje jako wspólna platforma laboratoryjna dla wielu testów (żywotność, ekspresja GFP/RFP, apoptoza), maksymalizując wykorzystanie urządzenia w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki skorelowanym danym wizualnym i ilościowym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wykonanie testu za pomocą jednorazowych szkiełek i zautomatyzowanej analizy obrazu, co poprawia powtarzalność i zmniejsza zmienność wynikającą z czynnika ludzkiego.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza harmonogramy odkryć, umożliwiając szybką iterację laboratoryjną bez ograniczeń związanych z planowaniem cytometrii przepływowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację opartą na ryzyku poprzez kwantyfikację żywych komórek z dodatnim transgenem, co podnosi jakość kandydatów przechodzących do kolejnych etapów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest podstawowe przeszkolenie w zakresie zasad mikroskopii fluorescencyjnej oraz bramkowania progowego dla parametrów fluorescencji i rozproszenia.
- Metoda opiera się na zastosowaniu cytometru obrazowego Tali, szkiełek do analizy komórkowej Tali oraz odczynnika Tali Viability Kit - Dead Cell Red do wykrywania żywotności w oparciu o PI.
- W celu uzyskania spójnych wyników konieczna jest standaryzacja protokołów barwienia, czasów inkubacji oraz procedur ustawiania ostrości pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji stężenia komórek i warunków barwienia ze względu na różnice w wielkości oraz autofluorescencji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują brak możliwości przeprowadzania wieloparametrycznego immunofenotypowania w więcej niż trzech kanałach oraz niekompatybilność z testami komórek adherentnych bez uprzedniej dysocjacji.
