Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

W niniejszym eksperymencie wykorzystano selektywną modulację izoform kinazy białkowej C w celu określenia ich funkcji mitochondrialnych i komórkowych w komórkach cewek proksymalnych nerek w różnych warunkach fizjologicznych i patologpecznych. Najpierw należy wyizolować pierwotne komórki cewek proksymalnych nerek z kory nerkowej lub RPC, które charakteryzują się metabolizmem oksydacyjnym przypominającym metabolizm cewek proksymalnych nerek.

Zakaźmy RPC wektorami adenowirusowymi wykazującymi ekspresję aktywnych i nieaktywnych form białka kinazy C. Następnie przeanalizujmy różne funkcje mitochondrialne oraz żywotność komórek, aby określić wpływ izoenzymu na zdolność mitochondriów do syntezy ATP i zapobiegania śmierci komórkowej. Przeprowadźmy również analizę immunoblottingu dla fosforylowanej kinazy C epsilon w połączonych lizatach komórkowych.

Wyniki wskazują, że aktywacja kinazy białkowej epsilon negatywnie reguluje zdolność mitochondriów do generowania ATP, obniżając komórkowe poziomy ATP oraz żywotność komórek kanalików bliższych nerek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi obecnymi metodami, takimi jak linie komórkowe, jest to, że pierwotne hodowle komórek kanalików bliższych nerek zachowują funkcje różnicowania i mechanizmy utleniania kanalików bliższych. Ponieważ kinazy białkowe mogą służyć jako cele i potencjalne środki terapeutyczne, zastosowania tej techniki obejmują terapię, zapobieganie uszkodzeniom nerek lub przyspieszanie regeneracji nerek po urazie.

Metoda ta pozwala na wgląd w mechanizmy uszkodzenia i regeneracji. Może ona zostać zastosowana m.in. w przypadku świeżo wyizolowanych nerek królika, które kolejno przepłukano 50 mililitrami sterylnego medium D-M-E-M-F 12, sterylnego roztworu soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,4 oraz roztworu tlenku żelaza w PBS, aby pobrać korę każdej nerki.

Najpierw należy zhomogenizować tkankę, używając homogenizatora o pojemności 15 ml. Następnie homogenizat należy przesiać przez dwa sterylne sita z siatką do jednego litrowego sterylnego zlewka. Komórki pozostałe na sitach należy wypłukać buforem zawierającym deferoksaminę.

Przenieś każdą pozostałą na dnie tkankę z sita o rozmiarze 85 micron do 40 mililitrów buforu zawierającego deferoksaminę, umieszczonego w stożkowej probówce wirówkowej. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą silnego magnesu.

Wyłap kłębki naczyniowe wypełnione żelazem i odessij żelazo przytwierdzone do magnesu. Doprowadź objętość zawiesiny komórkowej do 40 ml i dodaj 1 ml pożywki do trawienia zawierającej kolagenazę. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 17 minut.

Delikatnie wymieszać zawiesinę. Zebrać komórki poprzez wirowanie z prędkością 50 ×g przez dwie minuty w temperaturze 4 °C po kilku etapach płukania. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 46 ml pożywki nie zawierającej glukozy.

Pierwotne komórki RPC hodowano w gęstości jednego miligrama białka na płytkę w dwóch mililitrach pożywki D-M-E-M-F 12 pozbawionej glukozy na wytrząsarku orbitalnym w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po uzupełnieniu pożywki przystąpiono do infekcji konfluencyjnych komórek RPT adenowirusem niosącym CD NA dla albo konstytutywnie aktywnej kinazy proteinowej C epsilon, albo dominująco negatywnej kinazy proteinowej C epsilon; inkubowano przez 24 godziny, uzupełniono pożywkę i hodowano transfekowane pierwotne komórki RPC przez kolejne 24 godziny. Aby zwizualizować morfologię mitochondriów w monowarstwie pierwotnych komórek, uzupełniono pożywkę, dodano MIT tracker red five 80 i zwrócono płytki do inkubatora na 30 minut.

Następnie zbadaj żywe monowarstwy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu obiektywu imersyjnego z wodą. Cel drugi. Aby ocenić funkcję mitochondriów, oceń oddychanie w stanie trzy zawiesiny RPTC w komorze pomiaru zużycia tlenu wyposażonej w elektrodę typu Clarka.

Najpierw zmierz oddychanie stanu dwa w obecności DP. Następnie dodaj DP do stężenia końcowego 0,4 mM. Aby zainicjować oddychanie stanu trzy dla oddychania stanu cztery, dodaj oligomycynę do stężenia końcowego 0,5 µg/mL.

Należy również przeprowadzić pomiar oddychania niesprzężonego, dodając 0,5 µM FCCP do komórek oddychających w stanie trzy. Powoli dodaj 20 µL 0,5 mM roztworu JC-1 do każdej płytki z hodowlą RPTC i zamieszaj, aby dokładnie wymieszać barwnik. Włóż płytki z powrotem do inkubatora na 30 minut.

Następnie umieść hodowle w lodzie i przeprowadź dwa przemycia zimnym PBS. Potem zebrać komórki. Przenieś komórki RPT do probówki typu Eppendorf i rozbij monowarstwy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.

Analizę fluorescencji przeprowadźcie metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując wzbudzenie laserem argonowym o długości fali 488 nanometrów. Następnie obliczcie potencjał błonowy izolowanych mitochondriów. Umożliwi to ocenę integralności łańcucha oddechowego.

Po dwukrotnym przemyciu monowarstw RPTC lodowatym buforem PBS, zebrać komórki i sfragmentować je poprzez wirowanie. Osad przemyć raz w jednym mililitrze buforu A, a następnie zhomogenizować komórki w homogenizatorze typu Dounce aż do momentu, gdy podczas oględzin pod mikroskopem większość komórek w homogenacie okaże się rozbita. Następnie usunąć debris komórkowy poprzez wirowanie z niską prędkością.

Odwiruj surowe mitochondria z supernatantu przy 15 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przeprowadź trzy przemycia osadu mitochondriów w buforze c. Resuspenduj osad mitochondrialny w 50 do 100 µL buforu do testu i zamroź w ciekłym azocie, aby oznaczyć aktywność reduktazy NADH-ubichinonowej. Dodaj 500 µL buforu do testu wraz z dodatkami oraz mitochondria; uwzględnij również próbkę ślepą, zawierającą wszystkie dodatki bez mitochondriów. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez pięć minut.

Następnie umieść płytkę w spektrofotometrze i dodaj 10 µL 3,25 mM ubichinonu, aby rozpocząć reakcję w każdej z próbek. Zapisz absorbancję przy 340 nm przez trzy minuty w odstępach 22-sekundowych. W analogicznym teście zmierz aktywność cytochromu C oksydazy, wykorzystując zredukowany cytochrom C jako substrat dla reakcji syntazy ATP.

Przygotować mieszaniny do oznaczania całkowitej aktywności APAs oraz aktywności APAs niewrażliwej na oligomycynę dla każdej grupy badawczej. Inkubować próbki w mieszaninie reakcyjnej w temperaturze 31°C przez 10 minut. Rozpocząć reakcję poprzez dodanie substratu TP i inkubować w temperaturze 31°C przez pięć minut.

Przenieś 200 µL mieszaniny inkubacyjnej do probówki zawierającej 50 µL 3 M TCA, a następnie wytrąć białka na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj osad za pomocą wirówki. Dalej, do płytki 96-dołkowej nanieś po 50 µL każdego standardu fosforanu oraz 50 µL supernatantu z każdej próbki w dwóch powtórzeniach.

Następnie do każdej studni dodaj 250 µL odczynnika Sumnera i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 15 minut. Następnie zmierz absorbancję przy 595 nm. Przemyj monowarstwy RPTC dwukrotnie lodowatym buforem PBS.

Zabierz komórki w jednym mililitrze PBS i przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu einor. Odwiruj próbki RPTC w celu uzyskania osadu i wyznacz zawartość TP, wykorzystując metodę lucyferazową z zestawu do bioluminescencyjnego pomiaru ATP. Do analizy żywotności komórek w szalkach 35 milimetrowych użyj pięciu monowarstw RPTC dla trzech grup kontrolnych: komórek z pozytywnym wynikiem w kierunku nekrozy, komórek z pozytywnym wynikiem w kierunku apoptozy oraz kontroli bez barwienia dla dwóch szalek.

Dodaj dwa mikrolitry 50 milimolowego cisplatyny do drugiego zestawu. Dodaj dwa mikrolitry 500 milimolowego nadtlenku tert-butyloperoksydu. Po zabarwieniu komórek jodkiem propidynyum, zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście, przemyj monowarstwy buforem wiążącym.

Następnie należy zbarwić komórki przy użyciu ANNEXIN five sprzężonego z ZI, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Potem delikatnie zbierz komórki i zawieś je w 500 µL buforu wiążącego, używając gumowego policemana.

Za pomocą pipety rozdziel komórki do postaci zawiesiny jednokomórkowej, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówek do cytometrii przepływowej. Rozdziel komórki do postaci zawiesiny jednokomórkowej. Bezzwłocznie przystąp do ilościowego oznaczenia fluorescencji dla PI i FE za pomocą cytometrii przepływowej; adenowiralna dostawa CD NA powlekającej konstytutywnie aktywne i nieaktywne mutanty kinazy białkowej C epsilon prowadzi do znaczącego wzrostu poziomu białka kinazy białkowej C epsilon w RPTC oraz w mitochondriach.

Zgodnie z przewidywaniami, konstytutywnie aktywna forma enzymu ulega fosforylacji w RPTC, natomiast enzym dominująco negatywny nie jest fosforylowany. Obecność aktywnej kinazy białkowej C epsilon obniża oddychanie mitochondrialne w RPTC, niezależnie od substratu wykorzystanego do zasilania mitochondriów. Natomiast nieaktywna kinaza białkowa C epsilon nie wywiera wpływu na oddychanie mitochondrialne.

Co ciekawe, aktywacja kinazy białkowej C epsilon w RP TCS zmniejsza aktywność kompleksu I i IV. Ten spadek oddychania RPTC wiąże się ze wzrostem potencjału błony mitochondrialnej. Mutacja dominantno-negatywna nie wykazuje takiego efektu.

Zmiany te są również powiązane ze spadkiem aktywności syntazy ATP w mitochondriach wyizolowanych z RPTC z nadekspresją aktywnej kinazy białkowej C epsilon. W rezultacie zawartość ATP w RPTC z nadekspresją aktywnej kinazy białkowej C epsilon jest obniżona. Przeciągła aktywacja kinazy białkowej C epsilon wywiera głęboki wpływ na morfologię mitochondriów, co objawia się fragmentacją mitochondriów.

Aktywacja, a nie hamowanie kinazy białkowej C. Prowadzi to również do zmian w morfologii RPTC, powodując kurczenie się komórek i wydłużenie komórek przeżywających. Te mitochondrialne efekty nadekspresji aktywnej kinazy białkowej C epsilon w RPC korelowały również ze śmiercią komórek zarówno w wyniku onkozy, jak i apoptozy.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak nadekspresować białka w kulturach pierwotnych przy użyciu techniki adenowirusowej oraz jak ocenić wydolność mitochondriów w syntezie TP. Po opanowaniu tej metody, przy prawidłowym przeprowadzeniu, procedura ta zajmuje cztery godziny. Prosimy pamiętać, że praca z adenowirusami wiąże się z ryzykiem, dlatego należy podjąć odpowiednie środki ostrożności.