Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest określenie aktywności cytotoksycznych limfocytów T poprzez porównanie metody opartej na impedancji z wykorzystaniem systemu EXOGEN z testem uwalniania chromu. Pierwszy etap polega na oddzieleniu mononuklearnych komórek krwi obwodowej od krwi pełnej za pomocą fiolek. Następnie PBMC dodaje się do dołków wraz z antygenem peptydowym, ludzką rekombinowaną IL-2 oraz napromieniowanymi PBMC w celu wytworzenia antygenowo swoistych limfocytów T CD8+.

Antygenowo swoiste limfocyty T CD8 są następnie współhodowane z komórkami nowotworowymi w obu testach w celu wywołania śmierci komórek nowotworowych. Wyniki wykazują procentową lize komórek nowotworowych przy użyciu zarówno metody impedancyjnej, jak i testu uwalniania chromu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test uwalniania chromu, jest to, że system oparty na impedancji gromadzi dane w czasie rzeczywistym i wymaga mniejszej liczby komórek, które nie wymagają żadnego znakowania. W tym protokole krew od zdrowych dawców HLA-A2 dodatnich służy jako źródło PBMC (mononuklearnych komórek krwi obwodowej) zgodnie z protokołem producenta.

Użyj F call PA plus do oddzielenia P BMCs od krwi. Następnie do płytek 6-dołkowych wlej około 4 milionów P BMCs w 2 ml pożywki na każdy dołek. Do każdego dołka dodaj peptyd wiążący HLAA dwa, aby uzyskać końcowe stężenie 10 µg/ml w kulturze.

Komórki należy hodować w dniach naprzemiennych, aby stymulować i powiększać populację limfocytów T. Należy dodać świeżą pożywkę uzupełnioną o ludzką rekombinowaną IL-2 do stężenia końcowego 50 units per milliliter. Po jednym tygodniu należy przygotować kulturę autologicznych PBMC, naświetlić komórki i inkubować je przez dwie godziny z tym samym HLA.

Dwa peptydy wiążące w stężeniu 10 µg/mL stymulują ponownie hodowlę poprzez dodanie 1 mL napromieniowanego autologicznego PBM CS do każdej z nich. Należy kontynuować dodawanie świeżej pożywki uzupełnionej o IL-2 w dniach naprzemiennych; po kolejnym tygodniu należy ponownie stymulować hodowle w ten sam sposób. Po kolejnych sześciu dniach hodowli komórki będą gotowe do użycia.

Przygotuj stację do pomiaru impedancji inteligentnej poprzez inkubację w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej godzinę. Zbierz ludzkie komórki nowotworowe przy 75% konfluencji, używając 0,25% trypsyny i wirowania. Policz komórki nowotworowe za pomocą komory licznikowej (hemo-cytometru) i zawieś je w medium RPMI.

Pożywka z nowotworem o stężeniu 7 500 komórek na mikrolitr. W następnym programie, za pomocą oprogramowania Excel agent, skonfigurowano stronę układu z rozmieszczeniem studni. Na stronie harmonogramu ustawiono pomiary impedancji co pięć minut przez okres 40 godzin; przez pierwsze 18 godzin system Xceligent będzie mierzył impedancję wyłącznie komórek nowotworowych.

Następnie dodaj 100 µL pożywki RPMI do hodowli komórek nowotworowych na każdą studzienkę. Wykonaj pomiar tła dla wykorzystywanych EPL, mierząc impedancję w obecności samych elektrod, bez komórek. Po dodaniu komórek nowotworowych umieść płytki w stacji pomiarowej i rozpocznij rejestrację odczytów.

Komórki nowotworowe natychmiast zaczną przylegać do EPL. Po około 18 godzinach inkubacji komórki nowotworowe przyłączą się do EPL i ich liczba w każdej studzience podwoi się do 15 000. W tym czasie należy zebrać przygotowane limfocyty T, stosując delikatne skrobanie oraz wirowanie z mieszaniem.

Komórki T resuspenduj w podłożu RPMI z 10% FBS i policz je za pomocą komory countingowej. Po ustaleniu gęstości komórek przygotuj dwukrotny szereg rozcieńczeń komórek T w taki sposób, aby po dodaniu 200 µL komórek T do komórek nowotworowych, najwyższa koncentracja wynosiła 40 komórek T na jedną komórkę nowotworową. Ostatnie rozcieńczenie w serii powinno zapewnić 1,25 komórki T na jedną komórkę nowotworową.

Wstrzymaj pracę stacji EXOGEN i usuń EPL za pomocą pipety. Usuń medium z dołków, a następnie nanieś 200 µL limfocytów T we wszystkich stężeniach z serii rozcieńczeń jako kontrolę negatywną. Użyj czystego medium, przywróć EPL do stacji i kontynuuj program po zakończeniu analizy.

Znormalizuj wyniki. Podczas pracy z chromem 51 oraz komórkami docelowymi znakowanymi chromem 51 zawsze przestrzegaj instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa radiologicznego i stosuj osłony w celu ograniczenia ekspozycji na promieniowanie. Rozpocznij od inkubacji impulsem komórek nowotworowych przez dwie godziny w stężeniu 1 milion komórek na mililitr z dodatkiem 10 mikrolitrów na mililitr świeżego chromu 51.

Następnie komórki nowotworowe przemyć w 10 ml pożywki RPMI z 10% FBS, odwirować i zawiesić w tej samej pożywce w stężeniu 1 milion komórek na ml. Następnie do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem dodać 100 000 komórek nowotworowych na dołek, aby obliczyć spontaniczne uwalnianie.

Do sześciu z tych studni oraz do kolejnych sześciu studni nie dodawaj niczego więcej. Do wszystkich pozostałych studni dodaj 100 µL Triton X 100 w celu lizy komórek, aby obliczyć maksymalne uwalnianie. Do płytki dodaj limfocyty T, korzystając z wcześniej przygotowanej serii rozcieńczeń.

Następnie inkubuj płytki przez pięć godzin i pobierz próbki 50 µL supernatantu z każdej z nich, a następnie nanieś próbki na płytkę Luma po wysuszeniu płytek w dygestorium przez noc w temperaturze pokojowej. Zmierz ich CPM za pomocą licznika gamma dla limfocytów T oraz komórek raka SKBR3. Komórki nowotworowe hodowano na płytkach xCELLigence i mierzono indeks komórkowy, który jest odzwierciedleniem impedancji płytki, ponieważ limfocyty T do proliferacji nie wymagają adhezji.

Ich wpływ na impedancję był pomijalny podczas 40-godzinnej hodowli. Komórki nowotworowe hodowane samodzielnie wykazywały wzrost wartości impedancji. Jednakże dodanie limfocytów T w 18. godzinie przerywa ten trend.

Zdarzenie to wymaga normalizacji oprogramowania po dodaniu limfocytów T i jest dalej badane w kolejnym eksperymencie. Podczas kokultury komórek SK BR 3 z różnymi stężeniami limfocytów T, spadki impedancji były wyraźnie zależne od dawki limfocytów T; dane zbierano co pięć minut w trzech próbach w 10. godzinie. Wskaźniki komórkowe (cell indices) wykazywały zależność opisaną wielomianem drugiego stopnia w zakresie stężeń limfocytów T, co wskazuje, że stacja Exogen monitoruje w czasie rzeczywistym śmierć guzów SK BR 3 indukowaną przez limfocyty T CD8 jako spadek wskaźnika komórkowego, aby określić, czy spadki impedancji SK BR 3 wywołane przez limfocyty T były swoiste antygenowo.

Trzy linie komórkowe SK KBR współhodowano z HLA A2-dodatnimi T-komórkami specyficznymi dla FLU, które nie rozpoznają HER2-neu. Komórki te wykazywały znacznie mniejszą aktywność lityczną. Aby dalej ustalić, czy T-komórki specyficzne dla HER2-neu zabijają w sposób swoisty dla antygenu, do współhodowli wprowadzono przeciwciało przeciwko Fas ligand. Przeciwciało to nie zmniejszyło aktywności litycznej T-komórek specyficznych dla HER2-neu P 360 9.

Jednak w przypadku limfocytów T niespecyficznie aktywowanych za pomocą kulek anty-CD3/CD28, przeciwciało to hamowało lizę, co pozwoliło ustalić, czy zabijanie odbywało się w sposób zależny od HLA klasy I. Do kokultur dodano przeciwciało anty-HLA klasy I lub przeciwciało kontrolne izotypowe. Wyniki zdecydowanie potwierdziły tę hipotezę.

Następnie limfocyty T poddano kokulturze z innymi komórkami nowotworowymi w stosunku jeden do pięciu. Jako kontrolę negatywną wykorzystano linię komórek nowotworowych BT 20, która jest negatywna pod kątem HLA A2. Wyniki wykazują, że metoda ta jest użyteczna w przypadku wielu rodzajów adhezyjnych komórek nowotworowych.

Współhodowle HER2-specyficznych limfocytów T P360-9 dodano do komórek docelowych znakowanych chromem 51, a następnie przeprowadzono analizę CRA. Test odpornościowy wydaje się być bardziej czuły w analizie spójności. Zmienność wewnątrztestową obliczono jako procentowy współczynnik zmienności dla każdego stosunku komórek w zakresie od 1:40 do 1:5.

Wartość ta wynosiła poniżej 15% przy najniższych stosunkach komórek. Jednakże procentowy współczynnik zmienności (CV) był wysoki lub nieprzewidywalny. Dodatkowo zbadano zmienność lizy komórek T linii SK BR 3 w kokulturze z różnymi liniami komórek T specyficznych dla P 360 9.

Dane generowano w odstępach 30 dni. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki były bardzo zbliżone. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak określać aktywność limfocytów T cytotoksycznych z wykorzystaniem antygenowo specyficznych limfocytów T CD8 i komórek nowotworowych, stosując metodę opartą na impedancji.