In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie lokalizacji, liczebności oraz fenotypu antygenowo swoistych limfocytów T CD8+ w badanych tkankach. Metoda ta pozwala na szybkie uzyskanie odpowiedzi na pytania dotyczące limfocytów T CD8+, umożliwiając lokalizację, kwantyfikację i charakterystykę fenotypową praktycznie każdego antygenowo swoistego limfocytu T CD8+ w dowolnej tkance. Główną zaletą tej techniki jest możliwość określenia rozkładu przestrzennego antygenowo swoistych limfocytów T CD8+ w odniesieniu do innych komórek i struktur w badanych tkankach.

Procedurę w wykonaniu Shengbin Li zademonstruje Gwantwa Mwakalundwa. Pierwszego dnia procedury należy użyć skalpela, aby pociąć świeżą tkankę na kawałki o wielkości około 0,5 x 0,5 centymetra. W tym przypadku pokazano tkankę śledziony makaka rezusa.

Każdy fragment tkanki należy osobno przykleić do środka górnej części tłoka, a następnie zatopić próbki w trzech do pięciu mililitrów ciepłej 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w PBS. Tłoki należy opisać, podając odpowiednie informacje o tkankach. Następnie próbki należy umieścić w chłodzonym uchwycie w pojemniku z lodem.

Po zestaleniu agaru włącz mikrotom i ustaw grubość cięcia na 200 micrometers. Po zamontowaniu nowego ostrza wsuń tłoki do kąpieli mikrotomu. Napełnij kąpiel mikrotomu od 100 do 200 milliliters świeżo przygotowanego PBS-H i dodaj kostki lodu z PBS-H, aby utrzymać temperaturę w zakresie od zero do two degrees celsius.

Po uzyskaniu przekrojów o grubości 200 µm należy za pomocą pędzla usunąć agar otaczający każdy przekrój i przenieść próbki do oddzielnych komór tkankowych w poszczególnych studzienkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 1 mL schłodzonego PBS-H. Po pobraniu wszystkich próbek należy inkubować przekroje tkankowe przez noc w 1 mL tetramerów MHC klasy I obciążonych odpowiednim sprzężonym peptydem, rozcieńczonych w PBS-H uzupełnionym o 2% normalnej surowicy koziej, w temperaturze 4 °C przy stałym kołysaniu. Następnego dnia rano każdą komorę tkankową należy przenieść do oddzielnej studzienki nowej 24-dołkowej płytki zawierającej 1 mL świeżego schłodzonego PBS-H na 20 minut.

Po drugim płukaniu utrwal sekcje w 1 ml świeżego 4% paraformaldehydu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź dwa pięciominutowe płukania w zimnym PBS-H. Przenieś sekcje do nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 0,01 M mocznika i poddaj sekcje działaniu mikrofal trzy razy po około 10 sekund, aż mocznik zawrze.

Aby przeprowadzić permeabilizację i blokowanie próbek, inkubować skrawki w roztworze blokującym zawierającym PBS-H uzupełniony o 0,3% detergentu triton x100 oraz 2% normalnego surowicy koziej na wytrząsarce przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu inkubacji przenieść komory z tkanką do oddzielnych dołków nowej płytki 24-dołkowej zawierającej 1 mL roztworu z przeciwciałami królika przeciwko FITC, mysim przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD oraz szczurzym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD3. Inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.

Trzeciego dnia przemyć skrawki trzykrotnie w świeżym roztworze PBS-H w temperaturze 4 °C przez co najmniej 20 minut każdego płukania, a następnie przeprowadzić końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforem do trzech dni, chroniąc próbki przed światłem. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami wtórnymi opłukać próbki trzykrotnie w świeżym PBS-H przez 20 minut, a następnie za pomocą pędzla przenieść próbki z każdej komory tkankowej na szklany przedmiot do mikroskopu. Nałożyć na każdy skrawek medium montażowe z dodatkiem konserwantu fluoroforu i przykryć próbki szkiełkiem podstawowym.

Następnie przechowywać preparaty w pojemniku chroniącym przed światłem w temperaturze 20°C. W dniu obrazowania umieścić pierwszy preparat na stole mikroskopu konfokalnego i wybrać odpowiednie lasery oraz filtry dla każdego fluoroforu użytego do znakowania próbki tkanki. Przy użyciu obiektywu 20x sekwencyjnie wykonać serie obrazów w osi z w odstępach 3 µm w każdym z kanałów fluoroforów, w kilku polach o wymiarach 800 x 800 pikseli.

Następnie należy stworzyć montaż z zebranych pól i zapisać każdy obraz montażowy pod nazwą odpowiadającą odpowiedniej próbce tkanki. Na tych reprezentatywnych obrazach przekrój barwiony tetramerami MHC klasy pierwszej obciążonymi peptydem SIV jest porównywany z przekrojem z tej samej tkanki, barwionym tetramerami MHC klasy pierwszej obciążonymi nieistotnym peptydem, co demonstruje specyficzność barwienia tetramerami. Na obrazach tych limfocyty T swoiste dla wirusa, barwione tetramerem MHC klasy pierwszej obciążonym peptydem SIV, wykazują współbarwienie z CD8, markerem podzbioru limfocytów T, ale nie z CD20, białkiem powierzchniowym komórek ekspresjonowanym na limfocytach B.

Ten montaż został utworzony z wielu pól serii z konfokalnej, które posłużyły do ilościowego oznaczenia komórek barwionych tetramerem o specyficznych fenotypach w różnych przedziałach anatomicznych węzła chłonnego. To powiększone zdjęcie uwydatnia obszar montażu węzła chłonnego zawierający pęchyk komórek B wyznaczony przez barwienie IGM. Komórki barwione tetramerem MHC klasy pierwszej, z których niektóre koekspresowały marker aktywacji i proliferacji limfocytów T, KI67, można wykryć wewnątrz i na zewnątrz pęchyka komórek B.

Ta kombinacja barwień umożliwia określenie stanu aktywacji i proliferacji specyficznych dla SIV limfocytów T CD8+, a także ich lokalizacji w obrębie wtórnych tkanek limfatycznych. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu około pięciu dni. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że użycie świeżej tkanki jest kluczowe dla uzyskania pomyślnego barwienia.

Przetworzyć próbki w ciągu 24 godzin lub krócej od momentu pobrania, utrzymując je w niskiej temperaturze do czasu utrwalenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat przeprowadzania barwienia tetramerami oraz immunohistochemii w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu swoistych dla antygenu komórek T CD8+ w badanych tkankach. Należy pamiętać, że praca z czynnikami zakaźnymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności zapobiegających ekspozycji, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej oraz ograniczanie użycia ostrych narzędzi.