Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie i ilościowe określenie puli toksyny, która przedostaje się do cytozolu. Aby to osiągnąć, toksynę wiąże się najpierw z powierzchnią komórki gospodarza w temperaturze 4°C. Następnie usuwa się niewiązaną toksynę i ogrzewa komórki do 37°C, co umożliwia przemieszczenie się toksyny do systemu endomembran, a następnie do cytozolu gospodarza; po przejściu toksyny do wnętrza komórki stosuje się digitoninę w celu selektywnej permeabilizacji błony plazmatycznej.

Ekstrakty komórkowe są rozdzielane na osobne frakcje błonowe i cytozolowe przy użyciu wirowania różnicowego; w końcowym etapie wykorzystuje się powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) do wykrywania i ilościowego określania przenikania toksyny do cytozolu poprzez perfuzję frakcji cytozolowej nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem antytoksynowym. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii toksyn, takie jak wydajność i kinetyka wnikania toksyny do cytozolu, ilość toksyny przedostającej się do cytozolu oraz możliwość hamowania transportu toksyny do cytozolu przez leki. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy przygotować komórki HeLa do intoksykacji zgodnie z opisem w protokole pisemnym, po całonocnej inkubacji komórek HeLa.

Wymień pożywkę hodowlaną na 1 mL DMEM zawierającego 100 ng/mL gangliozydy GM1 i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Zwiększa to liczbę miejsc wiązania dla toksyny cholery, ponieważ receptor GM1 dla toksyn zostanie wbudowany w błonę plazmatyczną komórek eksponowanych na roztwór GM1.

Po jednej godzinie inkubacji usunąć pożywkę z GM i dwukrotnie przemyć komórki DMEM. Następnie dodać 1 ml DMEM zawierającego 1 µg/ml toksyny cholerycznej i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Usunąć pożywkę z toksyną i dwukrotnie przemyć komórki.

Następnie inkubować komórki w 1 mL DMEM w temperaturze 37 °C przez wybrany czas. Po zakończeniu każdego okresu wypłukiwania (chase) przemyć komórki PBS, a następnie inkubować każdą studzienkę z 250 µL 0,5 mM EDTA w PBS. Po 10 minutowej inkubacji w lodzie zebrać komórki z płytki 6-dołkowej poprzez energiczne triturację za pomocą pipety P 1000.

Po zebraniu komórek z jednej studni, połącz je z komórkami z drugiej, a następnie z trzeciej studni z tej samej grupy badawczej. Następnie umieść połączoną zawiesinę komórek z trzech powtórzeń w jednej probówce do mikrocentryfugi. Teraz wiruj probówkę w mikrocentryfudze nakładkowej przez pięć minut.

Przy 5 000 ×g dla wszystkich warunków powinny zostać otrzymane pellety komórkowe o zbliżonej wielkości. Odrzuć nadsącz, a następnie resuspenduj pellet komórkowy w 100 µl wcześniej przygotowanego i schłodzonego 0,04% roztworu roboczego digitoniny. Umieść zawiesinę komórkową w lodzie na 10 minut, a następnie używając mikrowirówki stołowej, odwiruj komórki przepuszczone przez digitoninę przy 16 000 ×g przez 10 minut.

Przenieś frakcję nadsączu zawierającą cytozol do nowej probówki do mikrowirówki, a frakcję osadu zawierającą organelle zachowaj. Standardy toksyny SPR przygotowuje się w stężeniach 110, 1 i 0,1 ng/mL w buforze HCN. Próbki przygotowuje się poprzez rozcieńczenie frakcji nadsączu zawierających cytozol w buforze HCN do końcowej objętości 1 mL. Objętości próbek wynoszące co najmniej 1 mL są niezbędne, aby zapewnić usunięcie powietrza z pętli próbkowej o pojemności 500 µL przed wstrzyknięciem. Frakcje osadu zawierające organelle resuspenduje się w 1 mL buforu HCN zawierającego 1% Triton X 100.

Dodanie detergentu jest niezbędne do uwolnienia puli toksyny zamkniętej w błonach. Należy również przygotować równoległe zestawy frakcji cytozolowych i frakcji organ L do eksperymentu kontrolnego w celu potwierdzenia dokładności procedury frakcjonowania; frakcję cytozolową zawiesić ponownie w 20 µL czterokrotnego buforu do próbek, a frakcję organ L w 120 µL jednokrotnego buforu do próbek. Równoważne objętości każdej frakcji należy rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu i poddać analizie Western blot, aby wykazać obecność białka cytozolowego we frakcji nadosadu oraz rozpuszczalnego białka retikulum endoplazmatycznego w frakcji osadu. Aby przygotować płytkę SPR, należy najpierw umieścić w urządzeniu SPR pozłacaną płytkę szklaną z samoporządkującą się monowarstwą.

Aktywuj slajd sensoryczny, przepływając roztwór E-D-C-N-H-S nad slajdem przez 10 minut z szybkością przepływu 41 µL/min. We wszystkich kolejnych etapach perfuzji stosujemy tę samą szybkość przepływu. Usuń bufor aktywacyjny E-D-C-N-H-S, płucząc płytkę przez pięć minut w PBS zawierającym 0,05%2020.

Płytka zawiera teraz reaktywne wiązania MI w wyniku odblokowania za pomocą roztworu E-D-C-N-H-S. Następnie należy przeprowadzić perfuzję przeciwciała anty-CTA nad aktywowaną płytką sensora w rozcieńczeniu 1:20 000 w 20 millimolarnym octanie sodu przez 15 minut. Ze względu na zmianę pH widoczny będzie początkowy spadek jednostek współczynnika załamania światła, w skrócie RIU.

Następnie nastąpi wzrost wartości RIU w miarę wiązania przeciwciała przez amidowe łączniki reaktywne. Z powierzchni płytki sensorycznej należy usunąć niewiązana przeciwciała poprzez pięciominutowe płukanie w roztworze PBST. Sygnał RIU generowany przez związane przeciwciała osiągnie plateau i ustabilizuje się, tworząc nowy sygnał bazowy.

Jako ostatni etap przygotowania płytki, przeprowadź PERFUZJĘ jednego molarnego etanolaminy nad płytką sensora przez pięć minut. Pozwala to na zablokowanie i dezaktywację wszystkich niezwiązanych łączników pozostałych na płytce sensora. Sygnał RIU wzrośnie, aby ustalić odczyt bazowy; przeprowadź perfuzję PBST nad pokrytym przeciwciałami sensorem przez pięć minut.

Następnie należy przeprowadzić perfuzję próbki doświadczalnej lub wzorca toksyny nad sensorem przez 300 sekund. Należy usunąć ligand z buforu i przeprowadzić perfuzję PBST nad sensorem przez kolejne 200 sekund. Wszelkie toksyny pozostające związane z sensorem są usuwane podczas 102. przemycia PBST o pH 5,0.

Doprowadzi to do powrotu sygnału do początkowego odczytu bazowego, co umożliwi przetworzenie kolejnej próbki na tym samym czujniku. Przed załadowaniem nowej próbki należy przepchnąć niewielką ilość powietrza przez pętlę próbkowania, aby usunąć resztki płynu z poprzedniej próbki. Po zakończeniu akwizycji.

Dane można analizować za pomocą oprogramowania scrubber two, natomiast oprogramowanie Igor może być wykorzystane do przygotowania rycin. Toksyna krztuśca jest toksyną typu AB, która przemieszcza się z powierzchni komórki do ER przed przedostaniem się jej łańcucha A do cytozolu.

Test translokacji oparty na SPR pozwolił wykryć PTs w cytozolu zatrutych komórek CHO. Brak sygnału z cytozolu komórek niezatrutych potwierdził swoistość przeciwciał anty-PTs. Jedno przeciwciało nie wykazywało reakcji krzyżowej z żadnym składnikiem cytozolu gospodarza.

Frakcja cytozolu z komórek poddanych intoksykacji w obecności feldenu. A również nie wygenerowała sygnału dodatniego, BFA zapobiega transportowi toksyny do miejsca translokacji w ER, a tym samym dostarczeniu łańcucha H do cytozolu. Choletoina jest inną toksyną typu AB translokującą się do ER.

W frakcji cytozolowej komórek HeLa traktowanych CT wykryto podjednostkę CTA1. Podkreśliło to, że opracowana metodologia działa w przypadku wielu typów komórek i może zostać zastosowana do dowolnej toksyny, dla której dostępne jest przeciwciało przeciwko łańcuchowi. Nie wykryto sygnału podczas perfuzji frakcji cytozolowej z komórek traktowanych CT nad sensorem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTB, co dowodzi, że w przeciwieństwie do podjednostki CT A1, wiążący się z komórkami PENTAMER CTB nie wnika do cytozolu.

Po perfuzji nad czujnikiem SPR pokrytym przeciwciałem anty-CTA. Sygnał z frakcji organelli przekracza skalę w porównaniu do słabszego sygnału z frakcji cytozolowej. Jest to zgodne ze znaną niską wydajnością transportu CT do miejsca translokacji w ER, co z kolei ogranicza ilość toksyny, która może dotrzeć do cytozolu.

Można również monitorować zależną od czasu akumulację translokowanej toksyny cytozolowej. Po ekspozycji komórek na CT w temperaturze 4°C, w cytozolu nie wykryto toksyny 15 minut po ogrzaniu do 37°C.

Niewielka pula toksyny cytozolowej została wykryta po 30 minutach w temperaturze 37°C, a sukcesywnie większe ilości toksyny cytozolowej odnotowano po 45 i 60 minutach okresu pogoni. Świadczy to o ciągłym, długofalowym dostarczaniu toksyny związanej z komórką do gospodarczego cytozolu. Test ten pozwala również wykryć hamowanie translokacji toksyny do cytozolu; komórki traktowane 10% DMSO wykazywały niski poziom cytozolowej CT1 w porównaniu z nieleczonymi, zainfekowanymi komórkami kontrolnymi, co wskazuje na hamowanie rozfałdowania toksyny.

Łańcuch jest warunkiem koniecznym do translokacji do cytozolu, zatem stabilizacja CT A₁ indukowana przez DMSO odpowiednio zapobiegła jego przemieszczaniu się z ER do cytozolu. Aby ilościowo określić indukowaną przez DMSO blokadę translokacji toksyny, wykorzystano krzywą wzorcową wygenerowaną z znanych stężeń toksyny, co pozwoliło obliczyć stężenie CTA₁ w cytozolu wynoszące 0,3 ng/ml dla komórek nieleczonych oraz 0,1 ng/ml dla komórek traktowanych DMSO. Inhibicja rozfałdowania CT A₁ przez DMSO doprowadziła zatem do trzykrotnego zmniejszenia translokacji CTA₁ z ER do cytozolu.

Po przeprowadzeniu tej procedury będziemy mogli wykorzystać inne techniki, takie jak testy toksyczności, aby ustanowić bezpośrednią zależność między ilością toksyny obecną w cytozolu a aktywnością toksyny.