Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płuc u pacjentów z nowotworami hematologicznymi z wykorzystaniem technologii przepływu bocznego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie zastosowania testu przepływu bocznego do szybkiej detekcji antygenu diagnostycznego Aspergillus w ludzkiej surowicy oraz płynach z BAL. Jest to realizowane poprzez uprzednie naniesienie próbki surowicy lub płynu BAL na port aplikacyjny urządzenia do przepływu bocznego. W drugim kroku należy pozwolić roztworowi na migrację wzdłuż membrany.

Kolejnym krokiem jest określenie, czy test jest prawidłowy, poprzez sprawdzenie linii kontroli wewnętrznej. Ostatnim etapem jest interpretacja wyniku testu na podstawie analizy linii testowej. W ostateczności urządzenie do przepływu bocznego jest wykorzystywane do wykrywania obecności antygenu diagnostycznego aspergillus w surowicy lub płynach z BAL.

Test LFD na obecność Aspergillus może być stosowany jako badanie pomocnicze w diagnostyce inwazyjnej aspergilozy płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy immunoenzymatyczne na obecność Aspergillus, galaktomannanu i mannanu, test na beta-glukan oraz test PCR na obecność Aspergillus, jest to, że jest to szybki test diagnostyczny typu point-of-care, wymagający minimalnego zaplecza laboratoryjnego i szkolenia. Choć LFD został opracowany do wykrywania gatunków Aspergillus, technologia przepływu bocznego może być zastosowana również do wykrywania innych patogenów zakaźnych, takich jak gatunki Cestosporium, Fusarium i Rhizopus.

Wprowadzenie przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla tych organizmów sprawia, że wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa. Ponieważ interpretacja wyników LFD wymaga zapoznania się z formatem testu, w celu pobrania surowicy z nieprzetworzonych próbek krwi należy pozwolić krwi skrzepnąć w temperaturze 4 °C; surowicę oraz płyn z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BAL) należy przechowywać w formie aliquotów w temperaturze -20 °C przed użyciem. Przechowywanie w aliquotach ogranicza potencjał degradacji antygenu docelowego w wyniku wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek podczas powtórnych badań. Aby przygotować próbki surowicy i BAL do badania, rozmrozić próbki w temperaturze pokojowej, a następnie utrzymać je w lodzie; dokładnie wymieszać za pomocą wortexa, a następnie wirować przez jedną minutę przy 14 000 RPM. Do rutynowych badań próbek ludzkich rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:1 z pożywką do hodowli tkankowej; alternatywnie, aby odseparować antygen docelowy od kompleksów immunologicznych surowicy, rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:2 w PBS zawierającym 4% EDTA, podgrzewać przez trzy minuty w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia i wirować przez pięć minut przy 14 000 RPM.

Płyny z BAL człowieka nie wymagają wstępnej obróbki. Próbka BAL po rozmrożeniu, wymieszaniu w wirówce typu vortex i odwirowaniu stanowi czystą próbkę, którą można nałożyć bezpośrednio na urządzenie do przepływu bocznego. Do celów testowania urządzenia do przepływu bocznego lub LFD są przechowywane w temperaturze pokojowej lub 23 °C, w której pozostają stabilne przez 12 miesięcy.

Aby rozpocząć analizę, należy wyjąć urządzenia z opakowań i umieścić je na płaskiej powierzchni. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety należy w ciągu kilku sekund nanieść 100 µL wstępnie przygotowanej surowicy do otworu dozującego urządzenia. Płyn powinien migrować siłami kapilarnymi wzdłuż membrany z octanu celulozy w oknie obserwacyjnym.

W ten sam sposób nanieś 100 µL czystej próbki BAL do otworu uwalniającego urządzenia. Pozostaw test na 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym należy odczytać wyniki. Nie należy przekraczać czasu 15 minut przed zapisaniem wyników testu.

Ponieważ może to wpłynąć na interpretację wyników, słabej reakcji nie należy wzmacniać poprzez wydłużanie okresu inkubacji. Test LFD składa się z wewnętrznej linii kontrolnej oznaczonej literą C na plastikowej obudowie oraz linii testowej oznaczonej literą T. Linia kontrolna powinna pojawić się zawsze, niezależnie od obecności antygenu aspergillus w surowicy lub próbce BAL. Wskazuje to, że test przebiegł prawidłowo, jeśli antygen aspergillus jest obecny w surowicy lub próbce BAL.

Linia testowa pojawi się również w ciągu 15 minut od naniesienia próbki. Intensywność reakcji w linii testowej oraz linii Lyme jest proporcjonalna do stężenia docelowego antygenu w próbkach surowicy i VAL. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest interpretacja wyników testu.

Wyniki testu LFD należy odczytać po 15 minutach, a wynik testu porównać z przedstawionym tutaj reprezentatywnym przykładem. Na tej rysunku pokazano reprezentatywne przykłady słabych, dodatnich, umiarkowanie dodatnich i silnie dodatnich wyników LFD dla próbek BAL oraz surowicy. Każda dodatnia linia testowa w próbce surowicy, niezależnie od intensywności, wskazywałaby na inwazyjną aspergillozę płucną lub chorobę IPA ze względu na obecność krążącego antygenu Aspergillus w krwiobiegu. Dodatnie reakcje w BAL, niezależnie od intensywności, wskazywałyby na kiełkowanie zarodników i rozwój potencjalnie patogennych strzępek w płucach.

W przypadku braku antygenu aspergillus linia testowa nie pojawi się, a wynik zostanie zapisany jako ujemny. Tabela ta przedstawia wyniki testów LFD z wykorzystaniem płynów z BAL pobranych od pacjentów z ostrą białaczką szpikową lub ML, zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi Grupy Badawczej Europejskiej Organizacji Badań i Leczenia Nowotworów oraz Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. W tabeli ujęto odpowiadające im dane kliniczne i psychologiczne, a także wyniki specyficznego testu PCR ASPERIA dla każdego pacjenta.

Zgodnie z wytycznymi E-O-R-T-C-M-S-G z 2002 roku, u pacjentów 12, 13 i 16 zdiagnozowano możliwe IPA na podstawie czynników gospodarza i kryteriów klinicznych lub dodatniego wyniku GM. Według zrewidowanych wytycznych E-O-R-T-C-M-S-G z 2008 roku, same czynniki gospodarza i dodatni wynik GM lub same czynniki gospodarza i kryteria kliniczne nie wskazywałyby na możliwe inwazyjne zakażenie grzybicze, chyba że towarzyszyłyby im odpowiednio dowody pomocnicze z danych klinicznych i mikologicznych. U pacjenta sześć zdiagnozowano prawdopodobne IPA według wytycznych z 2002 i 2008 roku ze względu na czynniki gospodarza, główne i poboczne cechy kliniczne oraz dodatni wynik GM.

Na koniec należy zauważyć, że mimo iż obecnie ani test LFD, ani test PCR nie są uwzględnione w wytycznych E-O-R-T-C-M-S-G w próbkach BAL pacjentów numer sześć i 12, istnieje silna zgodność między tymi dwoma metodami a komercyjnym testem galaktomannanowym, co wskazuje na obecność antygenu i kwasu nukleinowego aspergillus po zastosowaniu tej procedury. Równolegle można przeprowadzić inne metody, takie jak enzymatyczny test aminowy Pella Glactomannan, test panf na beta-glukan grzybiczy lub testy PCR na aspergillus, aby potwierdzić inwazyjną chorobę grzybiczą. Należy pamiętać, że praca z ludzkim surowicą krwi i płynami BAL może być niezwykle niebezpieczna, a operatorzy urządzenia powinni być zawsze zaszczepieni przeciwko takim chorobom jak zapalenie wątroby typu B i gruźlica.