Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu ekspozycji na etanol na rozwijające się danio pręgowane. Cel ten osiąga się poprzez wstępną ekspozycję zarodków danio pręgowanych na dawki etanolu w standardowej wodzie embrionalnej podczas wczesnego rozwoju. Następnie etanol jest usuwany, a ryby pozostawia się do rozwoju aż do pożądanego punktu czasowego.

Następnie w embrionach traktowanych, w porównaniu z kontrolnymi, analizuje się zarówno makroskopowe zmiany fizyczne, jak i zmiany w ekspresji genów. Na koniec embriony poddaje się manipulacjom przy użyciu mRNA, morfolino lub leków, aby ustalić, czy wady rozwojowe wywołane przez etanol mogą zostać zmienione. Ostatecznie połączenie ilościowego PCR i hybrydyzacji in situ wykazuje, że wpływ etanolu na rozwijające się embriony danio pręgowanego jest powiązany ze zmianą ekspresji genów.

Kolejne manipulacje poziomami ekspresji genów mogą poprawić stan lub zapobiec wadom rozwojowym wywołanym przez etanol. Techniki, które prezentujemy dzisiaj, rozszerzają naszą wiedzę na temat natury zespołu alkoholowego płodu, a także pozwalają na badanie zachowawczych procesów rozwojowych u kręgowców. Procedurę traktowania embrionów etanolem zademonstruje Steph Erhardt, technik w moim laboratorium.

Hodować je z par typu dzikiego do stadium kopułki w temperaturze 28 stopni Celsjusza w wodzie do embrionów. Podzielić embriony z jednego wysadzenia do odpowiedniej liczby szalek, mieszcząc od 10 do 50 embrionów w każdej szalce. Dodać do embrionów roztwór etanolu o stężeniu od 0,2 do 2,5% objętościowo w wodzie dla ryb, a następnie przenieść je z powrotem do inkubatora na okres do 24 godzin po pożądanym czasie ekspozycji.

Zastąp etanol zawierający wodę świeżą wodą do embrionów na określony okres rozwoju, aby zebrać mRNA do ilościowej PCR. Umieść dopasowane embriony H w probówkach typu Eppendorf. Odlej wodę z rybami i dodaj bufor lizujący z TCEP.

Używając zmechanizowanego homogenizatora, rozdziel fizycznie zarodki, a następnie umieść je w wirówce w celu powolnego wirowania. Przenieś roztwór do kolumny wstępnego oczyszczania, a następnie odwiruj kolumnę, aby usunąć oddzielone duże fragmenty.

Do wyizolowania RNA należy użyć zestawu do izolacji RNA. Następnie należy zsyntetyzować cDNA, stosując standardowe metody dla analizy qPCR lub mikromacierzy, aby przygotować zarodki do hybrydyzacji in situ oraz barwienia przeciwciałami. Zarodki w okresie od 6 do 24 godzin po zapłodnieniu należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4°C, a następnie trzykrotnie przemyć w PBS z dodatkiem 0,1% Tween.

Za pomocą dwóch ostrych pęset pod mikroskopem usuń choon. Następnie przenieś embriony do metanolu, stosując serię wymian cieczy o rosnącym stężeniu metanolu i malejącym stężeniu PBT. Po przeniesieniu embrionów do 100% metanolu, przechowuj je w temperaturze -20°C w celu barwienia chrząstki.

Hodować embriony do piątego lub szóstego dnia po zapłodnieniu. Utrwalić je przez noc w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyć je trzykrotnie w PBT, aby określić, jakie poziomy ekspresji genów uległy zmianie w wyniku ekspozycji na etanol.

Przeprowadź qPCR, rozpoczynając od zaprojektowania starterów w celu ich walidacji. Przetestuj je na trzech próbkach biologicznych. Te kontrolne próbki biologiczne mogą pochodzić od osobników w dowolnym wieku, pod warunkiem że badany gen wykazuje ekspresję w tym konkretnym wieku.

Po zweryfikowaniu starterów, należy wykorzystać wcześniej przygotowane cDNA do przeprowadzenia qPCR, analizując próbki w trzech powtórzeniach i uwzględniając próbkę kontrolną dla rybki danio-ostropłetwej; jako kontrolę stosujemy startery do gapdh. Wyniki należy znormalizować względem poziomów gapdh. Następnie oblicza się względny poziom ekspresji genów, stosując metodę 2⁻ΔΔCt.

Wariancja w metodzie 2^-ΔΔCT wykazująca różnicę w grupie eksperymentalnej w stosunku do typu dzikiego. W punkcie C przedstawiono dwa konstrukty hybrydyzacyjne. Znakowane sondy rybowe skierowane przeciwko genowi zainteresowania.

Następnie inkubuj je z embrionami w tym samym wieku w standardowych warunkach i wykryj wzór hybrydyzacji za pomocą fosfatazy alkalicznej; obrazuj próbki przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić rozwój morfogenetyczny, taki jak kształt; obrazuj żywe embriony w celu oceny odległości międzyocznej i długości ciała. Najpierw utrwal embriony w paraformaldehydzie. Następnie wykonaj zdjęcia, aby zbadać wpływ działania alkoholu na rozwijające się struktury chrzęstne w barwionych larwach.

Zafiksowano danio pręgowane, używając lc i niebieskiego światła przez kilka godzin aż do nocy, aby zatrzymać rozwój i utrwalić embriony przed obrazowaniem. Analizę śmierci komórek w żywych embrionach przeprowadzono poprzez inkubację w roztworze aine orange w stężeniu 5 mg/mL w PBS przez jedną godzinę. Embriony przemyto trzykrotnie w PBS, następnie zamocowano na szkiełkach przedmiotowych i poddano obrazowaniu przy użyciu mikroskopu konfokalnego, wykorzystując serie Z do stworzenia obrazów kompozytowych.

Po zidentyfikowaniu genów, których ekspresja uległa zmniejszeniu w wyniku ekspozycji na etanol, wstrzyknij od 25 do 200 pg/nl capped mRNA dla genu zainteresowania w stadium od jednego do dwóch komórek. Pozostaw jaja do regeneracji w inkubatorze nagrzanym do 28 °C, aż osiągną stadium kopułki, a następnie poddaj je działaniu etanolu w sposób opisany wcześniej. W przypadku genów, których ekspresja wzrosła w wyniku ekspozycji na etanol, przeprowadź ich wyciszenie poprzez wstrzyknięcie ilości od pikogramów do nanogramów morfino antisense do embrionów w stadium od jednego do dwóch komórek.

Protokół ten jest podobny do protokołu stosowanego dla mRNA z czapką. W przypadku wstrzykiwania mRNA lub morfolino przeciwko splicingowi, należy zmierzyć wydajność za pomocą R-T-P-C-R, aby porównać ilości transkryptów splicingowanych i niesplingingowanych w celu analizy aktywności genów zależnej od dawki; należy miareczkować wstrzykiwane morfolino i pozwolić zarodkom rozwijać się do pożądanego stadium przed podaniem im etanolu. Narażenie zarodków danio pręgowanego na etanol skutkuje szeregiem wad rozwojowych i genetycznych, które są powiązane z fenotypami występującymi u innych kręgowców.

Nieprawidłowy rozwój tkanek osiowych, w tym Noor, prowadzi do skrócenia, a niekiedy przerwania noord, co częściowo skutkuje późniejszymi nieprawidłowościami w somytach, jak pokazano tutaj. Podczas gdy nieleczone kontrole mają wyraźny kształt szewrona, somyty traktowane etanolem przyjmują kształt litery U, obserwowany przy zredukowanym sygnalizowaniu sonic hedgehog. Jak widać tutaj.

Kolejnym następstwem ekspozycji na etanol, prawdopodobnie wynikającym z wczesnego opóźnienia rozwojowego i następujących po nim wad Noor, jest skrócenie długości zarodka. Wynik ten jest podobny do utrzymywania się stanu przedpokwitaniowego oraz niskiego wzrostu obserwowanego u dzieci eksponowanych na etanol podczas rozwoju, co sugeruje, że model ryb zebrafish jest istotny dla zrozumienia tej ludzkiej wady wrodzonej. Wykazano na modelach zwierzęcych, że silna ekspozycja na etanol prowadzi do wyraźnych fenotypów zespołu alkoholowego u płodu, w tym synthia i opia.

U danio pręgowanych odległość międzygałkowa (IOD) zmniejsza się w sposób zależny od dawki etanolu, co jest zgodne z charakterem ludzkiej wady wrodzonej. Opia występuje jedynie przy bardzo wysokich dawkach, jednak niższe dawki wywołują istotną redukcję IOD, co sugeruje, że ten model zwierzęcy wykazuje podobną wadę rozwoju linii środkowej twarzy. Na niniejszej rycinie porównano wczesne poziomy ekspresji genów six3b oraz glee1 w embrionach nieleczonych i traktowanych etanolem.

W obu genach odnotowano obniżony poziom ekspresji w próbkach traktowanych etanolem. Z zastosowaniem hybrydyzacji in situ (NC) przeanalizowano wzorce ekspresji dla six3b oraz gooID, co przedstawiono na schemacie. W tym przypadku oba geny wykazały spadek ekspresji przestrzennej w embrionach traktowanych etanolem w porównaniu z nie traktowanymi kontrolami.

Ponieważ oba geny są ekspresowane w tkankach przeznaczonych na tkanki środkowej linii twarzoczaszki, ich redukcja w ósmym godzinie po zapłodnieniu jest spójna z redukcją IOD w późniejszym etapie rozwoju. Po zidentyfikowaniu genów, na które wpływa etanol, istnieją mechanizmy pozwalające na zwiększenie lub zmniejszenie ich ekspresji. W tym przykładzie wstrzyknięto mRNA dla sonic hedgehog, ligandu zwiększającego poziomy glee one, co doprowadziło do cofnięcia wad makroskopowych wynikających z redukcji glee one w embrionach traktowanych etanolem.

Iniekcja six three B nie była jednak w stanie odwrócić fenotypu wywołanego ekspozycją na etanol. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać wady genetyczne i rozwojowe wywołane przez etanol w rozwijającym się zarodku rybki danio. Techniki zastosowane w tym materiale mogą zostać wykorzystane również przez osoby chcące badać toksyczność innych związków rozpuszczalnych w wodzie w rozwijającym się zarodku kręgowca.