Implantacja modelu gąbki z alkoholu poliwinylowego

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie gąbki z alkoholu poliwinylowego do modelowania gojenia ran u myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie nawodnienie i załadowanie gąbki przed implantacją. Następnie gąbkę wprowadza się do kieszeni pomiędzy mięśniem brzusznym a skórą myszy.

Po implantacji do każdej gąbki można wstrzyknąć preparat leczniczy. Ostatnim krokiem jest usunięcie gąbek z organizmu myszy. W dalszej kolejności można przeprowadzić cięcie na przekroje, barwienie oraz analizy ilościowe, aby zaobserwować zmiany i warianty w procesie gojenia ran.

Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w proces gojenia ran, można ją również zastosować w innych obszarach badań, takich jak angiogeneza nowotworowa, dostarczanie leków oraz przeżywalność i przyjmowanie się wszczepionych komórek. Należy rozpocząć od nawodnienia gąbek poprzez mieszanie ich przez noc w 0,9% wodnym roztworze chlorku sodu. Następnie 75 ml zawiesiny nawodnionych gąbek należy autoklawować przez 25 minut w temperaturze 121°C.

Aby wysterylizować gąbki, umieść roztwór z gąbkami po autoklawowaniu w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie za pomocą sterylnej pęsety wyjmij jedną gąbkę, wyciśnij ją pęsetą i użyj końcówki próżniowej, aby usunąć z gąbki jak najwięcej roztworu. Następnie umieść wyciśniętą gąbkę w płytce do hodowli tkankowej, dbając o zachowanie odstępów między gąbkami, i nanieś pipetą roztwór do traktowania bezpośrednio na środek gąbki. Następnie delikatnie dociśnij gąbkę końcówką pipety, aby ułatwić wchłanianie roztworu.

Po załadowaniu wszystkich gąbek, przechowywać płytkę w lodzie do momentu implantacji gąbek do myszy. Po potwierdzeniu sedacji za pomocą testu odruchowego (uszczypnięcie), umieścić mysz w pozycji grzbietowej, stosując stożek nosowy. Następnie, używając golarki elektrycznej, usunąć sierść z obszaru o wymiarach jeden na jeden cal w dolnej części brzusznej myszy, poniżej klatki piersiowej.

Następnie przetrzeć obszar, aby usunąć odcięte włosy. Zdezynfekować ogoloną skórę Betadyną, a następnie 70% alkoholem. W kolejnym kroku naciągnąć skórę.

Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie pionowe o długości od półtora do dwóch razy większej niż średnica wkładanych gąbek. Należy uważać, aby nie przeciąć jamy ciała. Użyj pęsety, aby uchwycić krawędź skóry.

Następnie za pomocą nożyczek Metzenbauma powoli oddzielić skórę od mięśni po obu stronach nacięcia. Rozszerzyć kieszeń na szerokość ciała myszy, od klatki piersiowej aż do tylnych kończyn. Teraz, używając pęsety, chwycić pierwszą gąbkę przeznaczoną do umieszczenia w organizmie zwierzęcia, ściskając ją z boków.

Następnie przenieś gąbkę na parę pęset prostych w taki sposób, aby była utrzymywana od góry i od dołu. Następnie chwyć i unieś krawędź skóry drugą pęsetą i powoli wprowadź gąbkę, unikając dotykania skóry lub leżącego pod nią mięśnia. Po wprowadzeniu wszystkich gąbek użyj pęsety, aby zbliżyć do siebie oba brzegi nacięcia, a następnie przeprowadź nici chirurgiczne przez obie warstwy skóry.

Zaciśnij pierwszy splot wystarczająco mocno, aby zbliżyć brzegi skóry, a następnie zakończ węzeł kwadratowy kolejnym splotem w przeciwnym kierunku, tym razem mocno dociągając węzeł. Następnie zawiąż dwa kolejne węzły kwadratowe, aby zakończyć szycie.

Nałóż dodatkowe szwy, aby zamknąć całe nacięcie. Na koniec wyjmij zwierzę z systemu anestezji i monitoruj je, aż odzyska przytomność. Mysz powinna szybko zacząć się poruszać i powrócić do sprawności sprzed operacji.

Zacznij od napełnienia strzykawki odpowiednim roztworem i przymocuj do niej igłę o rozmiarze 28 G. Następnie, po potwierdzeniu sedacji poprzez uciśnięcie palca u stopy, wprowadź igłę w ciało zwierzęcia pod kątem 45 stopni przez skórę w centrum gąbek, aby upewnić się, że igła znajduje się w gąbce. Powoli podnieś igłę w pionie.

Jeśli igła znajduje się w gąbce, gąbka przesunie się w górę wraz z igłą. Następnie powoli wstrzyknij substancję do gąbki i wyjmij igłę. Po uśmierceniu zwierzęcia przytrzymaj skórę pęsetą i wykonaj nacięcie w pobliżu wybranej gąbki.

Na koniec ostrożnie oddziel gąbczaki od otaczającej kapsuły, unikając pobierania dodatkowej tkanki wokół usuwanego gąbczaka. Gąbczaki można przechowywać w różnych warunkach, w zależności od rodzaju analizy, która zostanie przeprowadzona. Do przygotowania skrawków pobrane gąbczaki można zatopić w medium mrożącym, takim jak optimal cutting temperature compound, lub umieścić w 10% formalinie w celu zatopienia i krojenia w blokach parafinowych, tak jak zrobiono to w przypadku tych gąbczaków barwionych H&E.

W przypadku tych przekrojów barwionych gąbek trireme najlepsze wyniki sekcjonowania uzyskuje się, gdy gąbka zostanie przecięta na pół wzdłuż średnicy, jak pokazano tutaj, a następnie zatopiona ciętą powierzchnią do dołu. Jak zademonstrowano tutaj, przekroje gąbki powinny być wykonywane w taki sposób, aby na rysunku widoczna była cała szerokość gąbki. Gąbka po lewej stronie została niewłaściwie zatopiona lub zsekcjonowana, o czym świadczy przerwana krawędź tkanki wzdłuż prawej strony przekroju, podczas gdy nienaruszona gąbka po prawej została przetworzona prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować, implantować, wstrzyknąć i usunąć gąbki z alkoholu poliwinylowego w celu badania gojenia ran u myszy.