Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest połączenie pobierania próbek ze świeżych produktów spożywczych za pomocą taśmy klejącej z molekularnym wykrywaniem całych komórek gatunków salmonella z wykorzystaniem szybkiej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Osiąga się to poprzez najpierw przyłożenie taśmy klejącej do pożąganego materiału i wyekstrahowanie komórek związanych z powierzchnią. Taśmy z ładunkiem komórkowym można analizować bezpośrednio lub poddać wzbogaceniu w fazie stałej lub ciekłej.

Drugim etapem procedury jest unieruchomienie na taśmie, autofiksacja i odwodnienie w serii etanolu dla komórek wprowadzonych do pożywki lub w niej namnożonych. Drugi etap obejmuje fiksację komórek w zawiesinie, a następnie ponowne zawieszenie komórek w buforze do przechowywania. Trzecim etapem procedury jest przeprowadzenie szybkiej hybrydyzacji na taśmie z wykorzystaniem koktajlu sond oligonukleotydowych specyficznych dla salmonelli, a następnie usunięcie nadmiaru sondy poprzez płukanie buforem piorącym; w przypadku próbek analizowanych metodą FISH, etap ten jest przeprowadzany w zawiesinie, a nadmiar sondy można usunąć poprzez proste rozcieńczenie przed analizą.

Ostatnim krokiem procedury jest przeciwbarwienie zhybrydyzowanych komórek związanych z taśmą za pomocą DPI i ich analiza pod mikroskopem fluorescencyjnym. W przypadku analiz opartych na faktach przeciwbarwienie nie jest wymagane. Ostatecznie metoda ta umożliwia wizualne lub cytometryczne wykrywanie gatunków salmonelli, które mogą występować w pobranych próbkach świeżych produktów rolnych.

Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas lektury publikacji włoskiej grupy, która stosowała podobne podejście do badania społeczności bakteryjnych na rzymskich reliktach z kamienia napowietrzającego. Wspólnie z r poprowadziliśmy dyskusję na temat tych prac podczas zajęć, które prowadziłem z szybkich metod w mikrobiologii żywności. Kilka tygodni później wybuch epidemii salmonelli, której źródłem były świeże produkty rolne, doprowadził ostatecznie do zachorowania niemal 1500 osób w 43 różnych stanach.

Choć nasze podejście eksperymentalne oferuje aktualną i praktyczną metodę wykrywania specyficznych typów bakterii na świeżych produktach, jest ono również na tyle przenośne, że umożliwia przeprowadzanie testów w terenie lub w środowisku produkcji żywności. Rozpocznij od wyboru taśmy do pobierania próbek. Dostępne opcje obejmują dostępne w handlu taśmy do grzybów lub taśmy kontaktowe, które są sterylne i zapakowane w sposób ułatwiający użytkowanie.

Za pomocą markera permanentnego i sterylnego szablonu aluminiowego narysuj kwadraty o boku 1 cm na nielepkiej stronie 10-centymetrowego odcinka taśmy klejącej. Będą one służyć jako pomoc wizualna do zaznaczenia, która część taśmy została wykorzystana do pobrania próbki z żywności lub powierzchni środowiskowej. Uformuj z taśmy pętlę w kształcie litery C, tak aby lepka strona była skierowana w stronę pobieranej próbki. Aby to zrobić, przytrzymaj lepkie końce kciukiem i palcem środkowym, a palec wskazujący oprzyj o narysowany kwadrat na plecach taśmy.

Nanieś taśmę na powierzchnię, z której pobierana jest próbka, i delikatnie dociśnij zaznaczony obszar do powierzchni, nie puszczając krawędzi taśmy. Palcem wskazującym upewnij się, że lepka strona taśmy w pełni przylega do powierzchni próbki. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza, wykonując równomierne ruchy.

Powoli odklej taśmę od próbki. Fizyczne usunięcie drobnoustrojów związanych z powierzchnią zwiększa ładunek komórkowy. Przyklej taśmę stroną klejącą do szkiełka przedmiotowego mikroskopu. Używając zwykłej przezroczystej taśmy biurowej, zapewnij odpowiednie naprężenie i rozciągnięcie taśmy, tak aby uzyskać płaską powierzchnię bez zmarszczek.

Pomoże to zminimalizować problemy z deformacją lub zwijaniem się taśmy podczas późniejszego ogrzewania. Podczas hybrydyzacji należy położyć taśmę stroną aktywną do dołu na płytkach agri xylose slicing tertile four lub XLT four, tak aby pobrane komórki miały bezpośredni kontakt z powierzchnią agri, co ułatwi późniejsze usunięcie taśmy z powierzchni płytki.

Po namnożeniu, część taśmy stykająca się z próbką matrycową zostaje umieszczona płasko na powierzchni agarowej, a jeden koniec taśmy zostaje luźno przyklejony. Szalki Petriego ustawia się dnem do góry, aby uniknąć kondensacji, i inkubuje w temperaturze 35 °C. Aby umożliwić wystarczający wzrost gatunków Salmonella, długość okresu inkubacji niezbędna do namnożenia komórek do poziomu wykrywalnego będzie zależeć od początkowego poziomu zanieczyszczenia Salmonella.

Po pożądanym okresie namnażania otwórz płytkę z agarem; taśma zachowa swoją lepkość podczas inkubacji. Delikatnie dociśnij taśmę do agaru palcem wskazującym, aby zapewnić maksymalne odzyskanie mikrokolonii powstałych na styku taśmy i agaru, chwyć taśmę za krawędź przylegającą do ścianki szalki Petriego i usuń ją powolnym, jednostajnym ruchem. Używając zwykłej przezroczystej taśmy biurowej, przymocuj taśmę z ładunkiem komórkowym stroną klejącą do góry do szkiełka przedmiotowego w taki sposób, aby uzyskać płaską powierzchnię bez zmarszczek.

Przeprowadź fiksację komórek na taśmie przez 30 minut w temperaturze 25 °C, pokrywając obszar kontaktu z próbką 500 µL 10% neutralnego buforu formaliny. Pozbądź się utrwalacza do szczelnego pojemnika pod wyciągiem chemicznym, aby zminimalizować ekspozycję na drażniące lub toksyczne opary; przemyj taśmę raz w 1x fosforanie buforze solnym (PBS), delikatnie zalewając powierzchnię taśmy roztworem PBS, a następnie odwodnij próbkę. Wykorzystując progresywną serię etanolu, przygotuj bufory do prehybrydyzacji, hybrydyzacji i płukania, stosując komercyjne roztwory klasy molecular biology grade; przefiltruj je za pomocą strzykawki z filtrem 0,22 µm i podgrzej bufory do hybrydyzacji oraz płukania do 55 °C.

Do podgrzanego buforu do hybrydyzacji należy dodać znakowane fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowe, aby uzyskać końcowe stężenie sondy wynoszące 5 ng/µL. Obszar kontaktu próbki z matrycą na taśmie należy pokryć 300 µL buforu do hybrydyzacji zawierającego koktajl sond, a następnie inkubować komórki związane z taśmą w wilgotnej, szczelnie zamkniętej komorze inkubacyjnej w temperaturze 55 °C (w przypadku inkubatora do bezpośredniego kontaktu, takiego jak urządzenie w trybie do slajdów) przez 15 minut. Po hybrydyzacji slajdy należy wyjąć, a nadmiar buforu do hybrydyzacji zawierającego sondę usunąć. Następnie należy krótko i delikatnie przepłukać próbki za pomocą pipety, używając podgrzanego buforu do płukania.

Niewielka objętość buforu na przechylonym szkiełku pozwala na wysuszenie preparatów na powietrzu w celu detekcji gatunków salmonella za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na szkiełko nanieść około 10 µL Vector Shield H 1200, medium montażowego zawierającego DPI, który służy jako barwnik przeciwjądrowy, i inkubować w ciemności przez 10 minut. Na szkiełko nakrywkowe nanieść olej immersyjny i zbadać próbki przy użyciu obiektywu olejowego o dużym powiększeniu.

Filtr DPI służy do ustawienia ostrości próbki. Następnie mikroskop przełącza się na odpowiedni filtr i dokonuje wizualnej oceny komórek salmonelli pod kątem zielonej lub czerwonej fluorescencji, w zależności od barwnika użytego do znakowania sond. Do detekcji cytometrycznej przenosi się próbki zawieszone w PBS do probówek do pobierania próbek o objętości 5 ml z okrągłym dnem i analizuje je za pomocą cytometru przepływowego z wzbudzeniem przy 647 nanometrach.

Analizę danych należy przeprowadzić przy użyciu oprogramowania FlowJo. Pobieranie próbek serowaru Typhimurium bakterii Salmonella z powierzchni sztucznie zanieczyszczonego pomidora za pomocą taśmy klejącej umożliwia bezpośrednią analizę powykroślną za pomocą mikroskopii lub ładowania komórek w cytometrii przepływowej. Taśmy poddano szybkiej hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ przy użyciu kombinacji specyficznych dla Salmonella sond DNA znakowanych Texas Red, w zależności od początkowego lokalnego stężenia komórek Salmonella na taśmie.

Wzbogacanie w fazie stałej przyniosło wyniki od odizolowanych mikrokolonii po wzrost zlewający. Komórki pobrane za pomocą taśmy można było analizować przy użyciu połączonej metody FISH i cytometrii przepływowej, albo bezpośrednio po pobraniu próbek, albo po pięciogodzinnym wzbogacaniu w fazie ciekłej. Wzbogacanie w minikulturach w temperaturze 35 °C.

Chociaż opisaliśmy zastosowanie techniki tape fish w kontekście bezpieczeństwa żywności, metoda ta ma również duży potencjał wykorzystania w innych dyscyplinach, w tym w mikrobiologii środowiskowej, patologii roślin lub mikrobiologii klinicznej. Równolegle do tej procedury, na wzbogaceniach w fazie stałej lub ciekłej z próbek wyekstrahowanych za pomocą taśmy, można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty, takie jak testy biochemiczne lub PCR. Testy te mogą służyć do odpowiedzi na pytania dotyczące potencjalnie obecnych szczepów salmonella, które wykraczają poza zakres procedury fish.