Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w późnym stadium embrionalnym oraz w okresie noworodkowym. W pierwszej kolejności przygotowuje się sprzęt. Igłę podłączoną do przetwornika ciśnienia należy wyrównać z sondą ultradźwiękową.

Następnie przygotowuje się mysz i wykonuje obrazowanie USG jej LV. Potem igłę wprowadza się do światła LV i rejestruje pomiary ciśnienia pulsacyjnego. Ostatecznie wyniki pokazują ciśnienia skurczowe u myszy w późnym okresie embrionalnym i wczesnym okresie neonatalnym z wykorzystaniem tej prowadzonej pod kontrolą USG cewnikowania z wypełnieniem płynem.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemy servo, pomiary bezciśnieniowe czy cewniki w stanie stałym, jest możliwość pomiaru ciśnienia u myszy w późnym okresie embrionalnym i noworodkowym w sposób stabilny i powtarzalny. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ utrzymanie orientacji embrionu w pęcherzyku zarodkowym jest wymagające ze względu na tendencję embrionu do obracania się. W przypadku zastosowania głowicy ultradźwiękowej, w zależności od badanego stadium rozwoju myszy, należy wybrać odpowiednią głowicę i napełnić ją wodą destylowaną.

Umieść głowicę w regulowanym uchwycie systemu ultradźwiękowego. Dostosuj uchwyt tak, aby uzyskać widok osi długiej lewej komory (LV) myszy zamocowanej do platformy, z wierzchołkiem LV skierowanym w stronę ramienia do iniekcji. System pomiaru ciśnienia składa się z wypełnionego płynem przetwornika ciśnienia, wzmacniacza mostkowego, systemu akwizycji danych oraz oprogramowania LabChart.

Pakiet oprogramowania, a strzykawka o pojemności 20 mililitrów wypełniona 10% roztworem soli fizjologicznej z heparyną służy do przepłukania przewodów. Należy upewnić się, że w przewodach lub nad przetwornikiem nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Przewody do przetwornika są połączone za pomocą kurków trójdrożnych, złączy luer-lock oraz kolców do węży.

Skalibruj system przetwornika ciśnienia za pomocą manometru, montując rurkę igłową i obudowę w ramieniu wtryskowym. Zastąp manometr obudową, która utrzyma rurkę przy ramieniu wtryskowym. Obudowa ta jest po prostu zmodyfikowanym korpusem strzykawki o pojemności trzech mililitrów.

Zaciśnij przetwornik ciśnienia w uchwycie pierścieniowym. Ustaw go na wysokości zbliżonej do poziomu platformy obrazującej, aby uniknąć zapychania. Do rurki igłowej przymocuj igłę o największej możliwej średnicy i wstrzykuj heparynowaną sól fizjologiczną, aż pojawią się kilka kropel.

Ponownie wysuń igłę. Upewnij się, że w przewodach lub nad przetwornikiem nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Następnie nałóż porcję żelu ultradźwiękowego na platformę obrazującą.

Obróć igłę w korpusie strzykawki o pojemności 3 mL tak, aby ścięta krawędź igły była skierowana do góry. Następnie, używając regulowanego statywu, ostrożnie wyrównaj sondę w taki sposób, aby igłę można było wprowadzić bezpośrednio do żelu. Pod środkiem sondy obrazującej igła musi znajdować się wystarczająco nisko, aby nie przebić osłony sondy, ale jednocześnie wystarczająco blisko, aby znajdować się w głębokości ogniskowania sondy.

W razie potrzeby igłę można zgiąć ręcznie tak, aby pozostawała w odpowiedniej płaszczyźnie przez cały czas przemieszczania. Zachowując osiowość, wycofaj igłę i podnieś głowicę obrazującą, aby umieścić mysz na platformie obrazującej. Wymień igłę przed przystąpieniem do znieczulenia myszy.

Znieczulono ciężarną mysz w określonym dniu ciąży lub mysz noworodkową poprzez ciągłą inhalację 1,5% izofluranu; do standardowego stożka nosowego można włożyć rurkę, aby dostosować go do małej głowy wczesnego noworodka myszy. W przypadku myszy noworodkowych unieruchom zwierzę na platformie obrazowej systemu ultradźwiękowego w pozycji leżącej na grzbiecie, tak aby szczyt LV był skierowany w stronę ramienia wtryskowego. W przypadku myszy noworodkowych należy utrzymywać temperaturę ich ciała za pomocą zewnętrznej lampy grzewczej.

Myszki w ciąży wymagają staranniejszego przygotowania. Nanieś żel do USG na kończyny, aby zapewnić sprzężenie z podłączonym detektorem EKG i monitoruj częstotliwość akcji serca. Wprowadź termometr rektalny w celu uzyskania informacji zwrotnej.

Kontrola temperatury ciała. Usunąć owłosienie z brzucha za pomocą kremu depilacyjnego i opłukać wodą. Rozciąć brzuch, używając nożyc preparacyjnych i pęsety zakrzywionej.

Wyciągnij jeden róg macicy i połóż go na zwilżonej ciepłym roztworem soli fizjologicznej gaziku. Przez cały czas trwania tej procedury utrzymuj wszystkie embriony oraz brzuch matki w stanie wilgotnym. Po okresowym dodawaniu ciepłej soli fizjologicznej ostrożnie przesuń embrion do odpowiedniej pozycji, aby uzyskać obraz lewej komory (LV) w przekroju podmostkowym wzdłuż długiej osi. Podczas korzystania z sondy ultradźwiękowej można użyć zwiniętego gazika, aby pomóc w utrzymaniu orientacji embrionu.

Należy przystąpić do pomiaru ciśnienia we wszystkich zarodkach w jednym rogu macicy, zanim proces zostanie powtórzony w drugim rogu macicy. Rozpocznij od nałożenia uprzednio ogrzanego żelu ultradźwiękowego Degas na embrion lub noworodka myszy. Obniż głowicę obrazującą i dostosuj kąt platformy obrazowej, aby uzyskać optymalny widok osi podłużnej LV w przekroju parasternalnym.

Nie należy zmieniać kąta nachylenia głowicy, ponieważ spowoduje to utratę osiowości igły. Monitorując obraz LV na ekranie USG, powoli posuwaj igłę, aż znajdzie się ona w pobliżu dolnej krawędzi głowicy. W razie potrzeby skoryguj położenie igły i głowicy, aby naprawić przesunięcia w osiowości.

Obraz z noworodka myszy wykazuje idealną orientację lewej komory (lv), co jest trudne do osiągnięcia w przypadku embrionu. Rozpocznij rejestrację danych ciśnienia. Delikatnie przemyj igłę solą fizjologiczną i zamknij kurek stopowy prowadzący do strzykawki 20 ml oraz do atmosfery.

Obserwuj ciśnienie. Zwiększ ustawienia w programie, aby upewnić się, że do igły przykładane jest minimalne ciśnienie. Powoli wysuwaj igłę, aż pojawi się ona na krawędzi obrazu USG, ale nie w jeszcze w lv.

W razie potrzeby skoryguj położenie igły, aby wprowadzić ją do LV w okolicy wierzchołka. Jeśli to konieczne, dostosuj pozycję głowicy, aby utrzymać wyraźny obraz igły. Wprowadź igłę do światła LV, rejestrując jednocześnie dane dotyczące ciśnienia i monitorując położenie igły na obrazie USG.

Pojawienie się zapisów pulsacyjnych z przetwornika ciśnienia potwierdza położenie igły wewnątrz światła LV. Jeśli igła wydaje się znajdować w świetle LV, ale zapisy ciśnienia nie są pulsacyjne, należy przepłukać igłę, lekko uderzając w tłok strzykawki, aż do momentu wykrycia wzrostu ciśnienia. Przepłukiwanie cieczą musi być minimalne, aby uniknąć zmiany pracy serca podczas pomiarów ciśnienia.

Jeśli odczyty ciśnienia nadal nie mają charakteru pulsacyjnego, igła może znajdować się powyżej lub poniżej właściwej płaszczyzny i nie być wprowadzona do światła LV. Wycofaj igłę, przemyj ją solą fizjologiczną i wprowadź ją ponownie.

Jeśli nadal nie udaje się uzyskać odczytów tętna, należy przejść do kolejnej myszy, zawsze używając nowej igły dla każdego zwierzęcia. Całą procedurę należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować stres zarodków i noworodków w trakcie trwania eksperymentu. Ciśnienie komorowe u myszy C 57 Black six J mierzono w stadium E 18.

Zgodnie z oczekiwaniami ciśnienie wynosiło niemal zero, gdy igła znajdowała się poza LV, natomiast po wprowadzeniu jej do LV u starszej myszy P 14 odnotowano odczyty pulsacyjne. Odczyt ciśnienia był stłumiony, ponieważ wartość ciśnienia była większa, a częstotliwość akcji serca wyższa. Częstotliwość akcji serca określono na podstawie częstotliwości pulsacyjnych odczytów ciśnienia dla różnych wieku od E 18 do P 14.

Zmierzono tętno i obliczono skurczowe ciśnienie w LV. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o okresowym nawilżaniu zarodków oraz sprawdzaniu stanu matki. Technika ta umożliwia badaczom fizjologii układu sercowo-naczyniowego analizę zmian ciśnienia tętniczego u rozwijających się myszy.